GABARAPL1通过阻断PI3K/Akt通路抑制前列腺癌转移

GABARAPL1在人转移性CaP细胞系和CaP肿瘤组织中下调

转移抑制基因在高转移肿瘤细胞中的表达水平通常低于低转移或非转移肿瘤细胞或正常细胞[18]. 为了检测GABARAPL1的表达模式是否与转移潜能反向相关，我们首先通过qRT-PCR评估了具有不同转移倾向的六种CaP细胞系和永生化人原代前列腺上皮细胞RWPE-1中GABARAP1 mRNA的表达。GABARAPL1在RWPE-1和LNCaP细胞中高表达（图​（图2A）。2安培). 更重要的是，GABARAPL1的表达与CaP细胞的转移能力呈负相关（图​（图2A）。2安培). 淋巴结转移变异体LNCaP/LN3和PC-3/LN4的GABARAPL1表达分别低于其亲本系LNCaP和PC-3（图​（图2A）。2安培). 高转移人CaP细胞系DU145和CWR22Rv1的GABARAPL1水平都很低（图​（图2A）。2安培). 除LNCaP细胞外，RWPE-1细胞与CaP细胞系之间的差异具有统计学意义(P（P）< 0.001). 此外，Oncomine数据库中的数据挖掘(http://www.oncomine.org)包括4项个人研究表明，与原发肿瘤样本相比，GABARAPL1在转移性CaP中显著下调，正常前列腺组织样本中GABARAP1表达最高（图​（图2B2B型).

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图2

GABARAPL1表达与CaP细胞和组织的侵袭性和转移性呈负相关

(A类)通过qRT-PCR评估具有不同转移能力的永生化前列腺上皮细胞RWPE-1和CaP细胞系中GABARAPL1的表达。误差条，三个独立qRT-PCR分析的SE***P（P）< 0.001; 显示的细胞与RWPE-1细胞相比。(B类)正常（Nor）、原发癌（PCA）或转移瘤（MET）中GABARAPL1 mRNA的表达水平。从Oncomine网站上的四项研究中获得的CaP组织：Lapointe等人[39]，LaTulippe等人[40]，Taylor等人[6]和Vanaja等人[41]. (C类)通过qRT-PCR评估80例CaP肿瘤组织样本（根据Gleason评分分类）和59例良性前列腺组织样本中GABARAPL1 mRNA的表达。P（P）插入的表格中显示了特定两组之间的数值：*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001. (D类)Kaplan-Meier图分析(http://www.cbioportal.org/public-portal/)Taylor等人进行的一项研究中174例CaP患者的无病时间对比[6]显示了。

为了进一步研究GABARAPL1表达与CaP细胞系转移的反向关系，采用qRT-PCR方法检测了80例CaP肿瘤组织和59例良性前列腺增生（BPH）患者前列腺组织中GABARAP1 mRNA的表达。总的来说，CaP肿瘤组织中GABARAPL1 mRNA的表达水平显著低于良性前列腺组织(P（P）<0.001）（图​（图2C）。2摄氏度). 在CaP肿瘤组织中，随着Gleason评分的增加，GABARAPL1逐渐丢失（图​（图2C）。2摄氏度). 此外，对包括174例CaP病例在内的已发表研究的数据进行分析[6]，在上提供cbio门户网站(http://www.cbioportal.org/public-portal/)结果显示，与142例（82%）GABARAPL1在CaP肿瘤组织中表达水平没有改变的患者相比，32例（18%）CaP肿瘤中GABARAP1表达下调的患者无病时间更短（图​（图2D）。二维). 这些数据强烈表明GABARAPL1的丢失与CaP的侵袭性相关。

敲除GABARAPL1促进LNCaP细胞侵袭

为了确定GABARAPL1的下调是否有助于CaP细胞的高转移能力，用两种不同的抗GABARAP1的shRNAs短暂感染LNCaP细胞，并用于评估对细胞运动性和侵袭性的影响。通过Western blot分析（图​（图3A）。3A级). 接下来，我们使用划痕“伤口”愈合试验检查GABARAPL1的敲除是否影响LNCaP细胞的运动。LNCaP细胞运动性差，因此在24小时内，shControl-transfacted LNCaP细胞仅部分覆盖了受伤的缝隙（图​（图3B）。3B公司). 相反，两个shGABARAPL1转染的LNCaP细胞中的任何一个在24小时内几乎覆盖了整个受损区域（图​（图3B），3B公司)表明GABARAPL1的敲除促进CaP细胞运动。为了进一步检查GABARAPL1在CaP细胞侵袭中的参与，在基于Matrigel的侵袭测定中使用了用shRNA-GABARAPL1感染的LNCaP细胞。shRNA-GABARAPL1感染导致(P（P）与控制shRNA感染相比，LNCaP细胞的侵袭性增加（图​（图3C）。3C公司). 相反，野生型GABARAPL1的过度表达导致CWR22Rv1细胞的侵袭性降低（图​（图3D）。三维). 总之，这些观察结果表明GABARAPL1可能是一种潜在的转移抑制因子。

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图3

Akt介导的FOXOs失活和FOXOs-诱导基因GABARAPL1的表达促进LNCaP细胞侵袭

(A类)通过shRNAs敲除GABARAPL1表达，并通过IB分析验证。β-actin为内部对照。(B类)通过刮擦用shControl、shGAB-1或shGAB-2转染的LNCaP细胞的汇合单层来引入伤口。在0和24小时通过光学显微镜监测迁移(C类)对转染shControl、shGAB-1或shGAB-2的LNCaP细胞进行基于基质的侵袭试验。计算每个字段的单元格数，并将结果汇总在条形图中。三份实验的误差条S.E*P（P）< 0.05. (D类)野生型GABARAPL1的异位表达降低了CWR22Rv1的侵袭性。通过IB分析评估GABARAPL1的蛋白表达（上面板）。GABARAPL1过度表达对Matrigel侵袭性的影响被量化（下表）。三份实验的误差条S.E*P（P）< 0.05. (E类)通过siRNA转染LNCaP细胞，FOXOs（FOXO1、FOXO3和FOXO4）被敲除。通过IB分析评估FOXO和GABARAPL1的蛋白表达。GADPH是内部负荷控制。(F类)对FOXOs敲除的LNCaP细胞进行基于Matrigel的侵袭试验。计算每个字段的单元格数，并将结果汇总在条形图中。三份实验的误差条S.E*P（P）< 0.05. (G公司)LNCaP细胞瞬时转染含有组成性激活Akt（myr-Akt）的载体。通过IB分析评估荧光蛋白Akt（Ser473）、荧光蛋白-FOXO1（Ser256）、FOXO1、荧光蛋白FOXO3（Ser253）、FOXO3和GABARAPL1的表达。GADPH是负载控制。(H（H）)用myr-Akt或对照载体转染的LNCaP细胞进行基于Matrigel的侵袭试验。计算每个字段的单元格数，并将结果汇总在条形图中。三份实验的误差条S.E*P（P）< 0.05. (我)用对照载体myr-Akt或myr-Akt加GABARAPL1瞬时转染LNCaP细胞。通过IB分析评估pAkt（Ser473）和GABARAPL1的表达水平。GAPDH是加载控制（上面板）。下图显示了表达对照、myr-Akt或myr-Abt加GABARAPL1的LNCaP细胞的基质侵袭试验。三份实验的误差条S.E*P（P）< 0.05.

FOXO缺失下调GABARAPL1并促进LNCaP细胞的侵袭

为了确定FOXO、GABARAPL1和CaP侵袭之间是否存在关系，用siRNA瞬时转染LNCaP细胞以对抗三种FOXO（FOXO1、FOXO3和FOXO4）或干扰对照siRNA，并进行基于Matrigel的侵袭分析。通过蛋白质印迹分析验证，三种FOXO蛋白被成功敲除（图​（图3E）。第三方). FOXO的敲除导致GABARAPL1的表达降低（图​（图3E）第三方)LNCaP细胞侵袭性显著增加(P（P）<0.05）（图​（图3F）。第三层). 这些数据表明FOXO可能通过调节GABARAPL1的表达来抑制LNCaP细胞的侵袭性。

激活Akt抑制FOXO及其靶基因GABARAPL1并促进CaP侵袭

PI3K/Akt通路是CaP进展的主要因素[4,5]. 当PI3K/Akt途径在CaP细胞中被激活时，Akt直接磷酸化FOXO，导致FOXO失活并滞留在胞浆中[19]. Akt激活还导致GABARAPL1的下调[15]. 因此，我们研究了Akt的激活是否可以通过FOXOs及其靶基因GABARAPL1的失活来促进LNCaP的侵袭性。组成活化Akt（myr-Akt）的表达促进FOXO1和FOXO3的磷酸化，同时降低GABARAPL1的表达（图​（图3G）。第三代移动通信). 此外，组成性激活Akt的表达增加了LNCaP细胞的侵袭性（图​（图3H）。3小时). GABARAPL1的强制表达减弱了myr-Akt增强的LNCaP细胞的侵袭性（图​（图3I）。第三章). 综上所述，这些数据表明Akt的激活抑制FOXO及其靶基因GABARAPL1，并促进CaP入侵。

细胞培养

如前所述，建立了感染DECODE（OpenBiosystems）混合pGIPZ慢病毒文库编码人类shRNAs的人类CaP LNCaP细胞[10]. LNCaP、PC-3、CWR22Rv1、RWPE-1和DU145购自中国细胞库研究院。RWPE-1、LNCaP、LNCaP/LN3和CWR22Rv1细胞在添加10%FBS的RPMI 1640培养基中培养，并在37°C的含5%CO2的加湿培养箱中培养。PC-3和PC-3M/LN4细胞在添加10%FBS的DMEM/F12培养基中培养。

临床样本

2013年3月至9月，在华山医院泌尿科和复旦大学附属肿瘤医院泌尿外科（中国上海）共采集了80份前列腺癌患者的CaP组织样本和59份对照前列腺组织样本。从徐州医学院附属医院（中国江苏徐州）获得了10对原发肿瘤和匹配的相邻非肿瘤组织样本。招募前已获得所有受试者的书面同意。本研究方案经华山医院伦理委员会、复旦大学肿瘤医院和徐州医学院附属医院批准。病理学家通过连续切片的组织学检查，确认所有肿瘤样本中含有80%以上的肿瘤细胞。根据1997年TNM分类对福尔马林固定标本进行病理检查后评估分期。受试者的临床和病理特征已在之前报告过[36].

瞬时转染

pLKO.1-shRNA-GABARAPL1质粒[37]根据制造商的方案，使用Lipofectamine试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）将组成性激活的Akt1（myr-Akt1）或对照载体与pEGFP DNA（Clontech/Takara，Mountainview，CA）瞬时共转染到LNCaP细胞中。pAd-GABARAPL1质粒[37]与pEGFP DNA瞬时共转染到CWR22Rv1细胞。将转染的LNCaP和CWR22Rv1细胞孵育40 h。GFP阳性细胞通过荧光激活细胞分选机进行分选，并用于Western blotting和侵袭分析。

原位CaP转移模型

如前所述，将睾酮颗粒植入6-8周龄雄性裸鼠（每组5只）的两侧[10]. 10⁶如前所述，将感染GFP标记的编码人类基因组shRNAs的慢病毒文库（9750个shRNA克隆/库中的7个库中的13650个靶基因）的LNCaP细胞原位注射到这些雄性裸鼠的前列腺背叶[10]. 10周后，处死小鼠，并使用全身成像检查原发性肿瘤和器官中是否存在GFP荧光（Lightools Research，Encinitas，CA）。收集盆腔淋巴结并用蛋白酶消化。将细胞悬液置于培养皿上，并选择用于耐嘌呤霉素（2μg/ml）转移性LNCaP细胞。所有动物实验方案均由深圳生物化学研究所动物护理和使用委员会批准。

siRNA转染

针对FOXO1、FOXO3或FOXO4的合成ON-TARGETplus SMARTpool siRNA、siCONTROL非特异性siRNA（NS-siRNA）和DharmaFECT-1转染试剂购自Dharmacon（Lafayette，CO）。LNCaP细胞被镀在6孔板（5×10⁴每口井）隔夜。按照制造商的方案，使用DharmaFECT1将50 nM的NS-siRNA或三种FOXO特异性siRNA转染细胞24小时。

免疫印迹（IB）分析

细胞在RIPA缓冲液中用蛋白酶抑制剂鸡尾酒进行裂解（德国曼海姆罗氏诊断公司）。用SDS-PAGE分离蛋白质样品（40μg），将其印在聚偏氟乙烯膜上，用5%牛血清白蛋白（Sigma）在1×TBS/T（0.1%吐温-20，Tris缓冲盐水）中封闭30 min，然后用指示的一级抗体进行探测。使用GeneTools软件对Chemi-Genius2生物成像仪（Syngene，Frederick，MD）进行数字成像和信号量化。

侵入试验

如前所述，进行改良的基于Matrigel的Boyden室分析[38]. 简单地说，用质粒或siRNAs转染的LNCaP或CWR22Rv1细胞被放置在侵入室的插入物中。添加FBS（10%）作为化学引诱剂。培养24小时后，用棉签从插入物中取出未穿透膜的细胞。使用Diff-Quik染色装置（Dade Behring Inc.，Newark，DE）固定和染色腔室，并在明亮视野显微镜下进行检查。计算每个膜（×20个目标）6个区域内的入侵细胞数，并给出三个独立实验的平均值。

免疫组织化学（IHC）和成像

如前所述进行IHC测定[36]. 简单地说，从前列腺切除术后的患者身上获取了10对原发肿瘤和匹配的相邻非肿瘤组织样本，并将其固定在10%的福尔马林缓冲液中，嵌入石蜡中，并在4微米处切片。将载玻片在数个二甲苯浴中脱para化，然后在分级乙醇系列中再水化，然后加入ddH2O。将p-Akt（Ser473）（1:500）和GABARAPL1（1:500。使用奥林巴斯BX53显微镜扫描载玻片，并使用Cellsens Entry（奥林巴斯）观察载玻片。免疫反应性的强度（强度评分）以0-4:0的任意尺度进行判断，为阴性；1、弱；2、中度；3，强壮，4，非常强壮。此外，根据显示每个强度评分的组织面积百分比，对样本进行百分比评分。通过将强度得分和百分比得分相乘，计算每个样本的组织核心。因此，组织核心从0到400不等。

定量逆转录酶PCR（qRT-PCR）

使用TRIZOL试剂（Sigma）分离总RNA，并使用Revert Aid First Strand cDNA合成试剂盒（Thermo Scientific）将其逆转录成cDNA。使用SYBR预混料EX-Taq（TaKaRa）进行实时PCR，并使用CFX96实时系统（BIO-RAD）进行分析。PCR引物序列如下：GABARAPL1：正向，5′-AGGAGGACCATCCCTTTGAGT-3′；背面为5′-TGGCCAACAGTAAGGTCAGA-3′。β-肌动蛋白：正向，5′-GACCTGACTACTTCATGAAGAT-3′；背面为5′-GTCACCTCTCATGATGGAGTTGAAG G-3′。β-actin被用作qRT-PCR反应的看家基因。每项测试都是在三重复制中进行的^-ΔΔCt方法[26]用于计算基因的表达。

我们感谢罗斯韦尔公园癌症研究所（美国纽约州布法罗）的Irwin H.Gelman博士，感谢他用Decode RNAi病毒库和myr-Akt1质粒感染LNCaP前列腺癌细胞系。华山医院（中国上海）的Ming Guan医生负责前列腺癌组织。作者感谢深圳生物医学研究支持平台提供的卓越技术援助。