营养生物化学杂志。作者手稿；2017年5月1日PMC提供。
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NIHMSID公司：美国国立卫生研究院759374
小分子托芬那酸和食用香料姜黄素治疗通过抑制Sp1、干扰NF-kB向细胞核的转运和细胞周期相分布增强胰腺癌细胞的抗增殖作用
,1,2,* ,4 ,1 ,5 ,1 ,1 ,1 ,1 ,5 ,1,2,三和5
利亚兹·巴沙
1德克萨斯州沃思堡北德克萨斯大学健康科学中心癌症研究所，邮编：76107
2德克萨斯州沃思堡北德克萨斯大学健康科学中心临床前服务，邮编：76107
莎拉·康奈利
4佛罗里达州奥兰多市奥兰多安德森癌症中心医学博士，邮编：32806
乌梅什·桑帕尔
1德克萨斯州沃思堡北德克萨斯大学健康科学中心癌症研究所，邮编：76107
Ganji Purnachandra Nagaraju公司
5佐治亚州亚特兰大埃默里大学温希普癌症研究所血液学和医学肿瘤学系30322
哈萨安·帕特尔
1德克萨斯州沃思堡北德克萨斯大学健康科学中心癌症研究所，邮编：76107
Jamboor K.Vishwanatha公司
1德克萨斯州沃思堡北德克萨斯大学健康科学中心癌症研究所，邮编：76107
萨加·谢拉克
1德克萨斯州沃思堡北德克萨斯大学健康科学中心癌症研究所，邮编：76107
莱斯利·塔博·西梅卡
1德克萨斯州沃思堡北德克萨斯大学健康科学中心癌症研究所，邮编：76107
马莫鲁·绍吉
5佐治亚州亚特兰大埃默里大学Winship癌症研究所血液学和医学肿瘤学系，邮编30322
杰里·西梅卡
1德克萨斯州沃思堡北德克萨斯大学健康科学中心癌症研究所，邮编：76107
2德克萨斯州沃思堡北德克萨斯大学健康科学中心临床前服务，邮编：76107
三德克萨斯州沃思堡北德克萨斯大学健康科学中心药学学院，邮编：76107
Bassel El-Rayes公司
5佐治亚州亚特兰大埃默里大学Winship癌症研究所血液学和医学肿瘤学系，邮编30322
1德克萨斯州沃思堡北德克萨斯大学健康科学中心癌症研究所，邮编：76107
2德克萨斯州沃思堡北德克萨斯大学健康科学中心临床前服务，邮编：76107
三德克萨斯州沃思堡北德克萨斯大学健康科学中心药学学院，邮编：76107
4佛罗里达州奥兰多市奥兰多安德森癌症中心医学博士，邮编：32806
5佐治亚州亚特兰大埃默里大学Winship癌症研究所血液学和医学肿瘤学系，邮编30322
- 补充资料
补充。
指南：53DF1B2D-CB68-4BC3-ADCC-AFCB6BDF4779
摘要
饮食/草药香料姜黄素（Cur）和COX抑制剂的组合已被测试用于提高胰腺癌（PC）的治疗效果。本研究的目的是确定与Cur一起使用时，能够诱导PC细胞生长抑制的低毒且不依赖COX机制的药物。使用PC细胞系评估抗肿瘤非甾体抗炎药、托非那酸（TA）和Cur联合用药。用Cur（5–25μM）或TA（25–100μM）或Cur（7.5μM）和TA（50μM）的组合处理L3.6pl和MIA-PaCa-2细胞。使用CellTiter-Glo试剂盒在治疗后24–72小时测量细胞活力。虽然这两种药剂都表现出稳定/一致的效果，但Cur+TA引起了更高的生长抑制。比较了COX抑制剂布洛芬和西乐葆的抗增殖作用。使用心肌细胞（H9C2）评估心脏毒性。检测Sp蛋白、survivin和凋亡标记物（Western blot）、caspase 3/7（caspase-Glo kit）、Annexin-V染色（流式细胞术）、活性氧（ROS）和细胞周期相分布（流式细胞学）的表达。用TNF-α处理细胞，并评估NF-kB从细胞质到细胞核的易位（免疫荧光）。与单独用药相比，Cur+TA联合用药导致凋亡标记物、ROS水平显著增加，NF-kB转位增加。TA引起G细胞周期阻滞0/G公司1联合治疗主要表现为DNA合成期阻滞。这些结果表明，Cur+TA联合使用毒性较小，并通过COX非依赖性机制有效增强了对PC细胞的治疗效果。
关键词：胰腺癌、托非那酸、姜黄素、Sp1、联合治疗
1.简介
长期以来，人们对草药产品的医疗效益进行了广泛研究[1——三]. 姜黄素（Cur）是一种天然酚类化合物，是膳食香料姜黄中的活性成分(姜黄L.）。Cur[1,7-双-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1,6-庚二烯-3,5-二酮]对炎症、缺血、癌症和衰老具有广泛的生物作用。过去50年的广泛研究表明，Cur可以预防和治疗癌症[4,5]. Cur在包括胰腺癌（PC）在内的几种恶性肿瘤中观察到抗致癌作用[6], [7——10]. PC是一种侵袭性疾病，预后不良，生存率通常取决于某些信号分子的突变状态[11]. 第一阶段临床试验表明，Cur可以以非常高的剂量（6克/天）安全地施用[12]. 然而，口服时发现生物利用度低。II期试验也支持了PC患者中Cur的生物活性，显示出明显的肿瘤消退[13].
某些策略，如药物输送系统、合成类似物已被测试以克服生物利用度问题[14——19]. Cur与其他药物联合应用也在一些癌症中进行了研究[20]. Cur在宫颈癌细胞中也表现出放射增敏反应[21]. 这些研究表明，Cur用于联合治疗时可能有效。在MD Anderson癌症中心进行的临床试验中，对Cur和吉西他滨（Gemzar）联合用药进行了测试。另一项临床试验已获批准，用于测试Cur、Gemzar和一种非甾体抗炎药（NSAID）西乐葆联合治疗转移性PC的疗效。虽然Cur与上述候选药物的联合作用已得到相对良好的研究，同样重要的是要看到其他潜在的作用靶点，尤其是COX非依赖性机制，以提高Cur的抗癌活性。在这项研究中，我们测试了一种涉及特异性蛋白（Sp）转录因子抑制剂和Cur的组合。
转录因子家族调节多种参与细胞周期、增殖、细胞分化、凋亡等关键过程的基因，并与许多人类癌症相关[22——26]. Sp1是一些癌症患者生存的负面预后因素[27,28]. 据推测，Sp（Sp1、Sp3和Sp4）转录因子与富含GC的启动子位点结合，调节负责癌细胞增殖和存活的关键基因集[26]. 我们小组和其他小组先前的实验室研究证明了以Sp蛋白为靶点治疗各种癌症的重要性[29——32]. 在PC临床前模型中筛选了几种代表不同结构类别的小分子（NSAID）靶向Sp蛋白后，托非那酸（TA）被引入为一种有效的抗癌药物[32]. TA通过诱导Sp1、Sp3和Sp4的降解降低原位小鼠模型中PC细胞的生长并抑制转移[32].
在目前的研究中，我们研究了Cur和TA联合处理对PC细胞生长的影响。使用L3.6pl和MIA PaCa-2细胞测试使用每种药物的优化剂量的单独和联合治疗。比较其他非甾体抗炎药布洛芬（Ibu）和西乐葆（Cel）的抗增殖作用和TA的作用。细胞活性结果与Sp1、survivin和与凋亡相关的标记物（凋亡细胞群、PARP裂解和caspases 3/7活性）的表达的影响相一致。由于联合治疗对细胞生长的抑制很大，细胞周期的相位分布也在单独和联合治疗Cur和TA后测定。此外，使用流式细胞仪测量活性氧物种（ROS）的激活，并通过免疫荧光评估NF-kB从细胞质到细胞核的移位的影响。
2.材料和方法
2.1细胞系和化学品
本研究使用人胰腺癌细胞（L3.6pl，MIA-PaCa-2）和心肌细胞（H9C2）。L3.6pl细胞来自德克萨斯州休斯顿市德克萨斯大学MD安德森癌症中心。MIA PaCa-2和H9C2细胞购自ATCC（弗吉尼亚州马纳萨斯）。细胞在补充有胎牛血清和1%抗生素（Pen/Strep）的DMEM培养基中生长，并保持在37°C和5%CO的条件下2.
抗体购自加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术公司（Sp1，Sp3）；研发系统公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州（survivin）；细胞信号技术，丹弗斯，马萨诸塞州（c-PARP）。托非那酸、布洛芬、西乐葆、二甲基亚砜（DMSO）、蛋白酶抑制剂和β-肌动蛋白购自西格玛化学公司（密苏里州圣路易斯）。药盒购自加利福尼亚州圣何塞BD Biosciences（Annexin-V/7-AAD）；伊利诺伊州罗克福德市皮尔斯（BCA蛋白分析）和威斯康星州麦迪逊市普罗米加（CellTiter-Glo和Caspase-Glo 3/7）。试剂从Mediatech，Manassas，VA（PBS，DMEM）获得；加利福尼亚州卡尔斯巴德Invitrogen（细胞裂解缓冲液）和伊利诺伊州罗克福德Pierce（西杜拉超级信号公司）。
2.2细胞活力
用CellTiter-Glo试剂盒测定PC细胞和心肌细胞（H9C2）的细胞活力。将PC细胞置于96个平板（瑞士巴塞尔Lonza）中，并用二甲基亚砜（对照）或增加（25–100μM）浓度的非甾体抗炎药（TA、布洛芬和西乐葆）或Cur（5–25μM）处理。在指定时间，添加处理后（24/48/72 h）分析试剂（1:1比例）。在黑暗中培养15分钟后，使用FLUOstar Optima（BMG Labtech）或Synergy HT（BioTek）平板读取器测量发光。将数据（一式三份样品）归一化为对照细胞，并以活细胞百分比表示。
2.3组合指标
为了确定TA和Cur同时治疗是否产生协同效应，使用Chou-Talalay方法计算组合指数（CI）[33]. PC细胞与不同浓度的TA和Cur（恒定比例为50:7.5）孵育48小时。使用CellTiter-Glo试剂测量细胞存活率，并使用CalcuSyn软件（2.0版）计算药物相互作用的CI值。英国剑桥Biosoft）。CI值小于1.0表示协同作用。
2.4使用流式细胞术检测细胞凋亡（Annexin-V染色）
L3.6pl和MIA PaCa-2细胞用载体（DMSO）或TA（50μM）或Cur（7.5μM）处理，或两者（TA+Cur）处理。使用膜联蛋白V凋亡检测试剂盒（膜联蛋白V-PE/7-AAD）检测凋亡细胞。简言之，在处理后48小时收集细胞，并与膜联蛋白V-PE和7-AAD在1X结合缓冲液中孵育15分钟。孵育后，对细胞进行处理，通过流式细胞仪（BD FACSCalibur流式细胞仪）测定凋亡前、凋亡和坏死细胞的百分比。数据通过FlowJo软件（Tree Star，Inc.，阿什兰，OR）收集和分析。
2.5免疫印迹
用DMSO或50μM TA或7.5μM Cur或两者（TA+Cur）处理L3.6 pl和MIA PaCa-2细胞，并在处理后48小时收集细胞。制备蛋白质提取物，并如前所述通过蛋白质印迹分析测定感兴趣蛋白质的表达[32].
2.6半胱氨酸蛋白酶激活分析
使用Caspase-Glo 3/7试剂盒评估TA或Cur或TA+Cur对效应器caspases活性的影响。如上所述接种PC细胞并进行处理。48小时后，将分析试剂（1:1比例）添加到每个孔中。将平板混合并在黑暗中孵育约60分钟。使用FLUOstar Optima（BMG Labtech）平板阅读器测量发光度。所有样品均测量了三份，数据显示为平均值±SEM。
2.7活性氧物种估算
使用氧化应激指示剂CM-H2DCFDA，使用流式细胞仪测量ROS水平。简单地说，PC细胞用TA或Cur或TA+Cur或H处理2O（运行）2（阳性对照）。24小时后，收集细胞，并在37°C的黑暗中与5μM CM-H2DCFDA孵育30分钟。荧光定量，并使用几何平均荧光值作为每个群体的平均荧光值。
2.8 NF-kB移位
PC细胞接种在盖玻片上，并在6孔板中生长。用TNFα（15 ng/ml）处理细胞，诱导NF-κB向细胞核移位。同时，用TA（50μM）或Cur（7.5μM）或者TA+Cur处理细胞株。处理24小时后，用冷甲醇固定PC细胞（10分钟），用PBS洗涤，然后用山羊血清封闭1小时。然后用（1:200）NF-κB抗体孵育细胞2小时，用0.1%PBS-Tween洗涤，用与Alexa Fluor 488偶联的山羊抗兔抗体（1:400）孵育2小时。使用具有DAPI的Vectashield安装介质将细胞安装在载玻片上。使用奥林巴斯AX70垂直荧光显微镜获取图像。
2.9统计分析
使用单向方差分析对数据进行分析。结果表示为平均值±SEM。评估处理细胞和未处理细胞之间的显著性，并第页值<0.05为显著。
3.结果
3.1 TA和Cur组合对细胞生长的抑制作用更强
使用两个PC细胞系研究Cur+TA组合的作用。用载体或TA（25/50/75/100μM）或Cur（5/7.5/10/20μM）处理L3.6pl和MIA PaCa-2细胞，并检测24、48和72小时的细胞活力。TA或Cur处理抑制了两种细胞系，表现出剂量和时间依赖性反应(). 治疗后48小时，50μM剂量的TA诱导的细胞生长抑制率为30–50%，75μM剂量为60–80%。同样，48小时时，L3.6pl和MIA-PaCa-2细胞的Cur（7.5μM）抑制率分别为24%和22%。治疗后24–72小时抑制率的详细信息见补充数据（表1和表2；图S1和S2.IC50MIA PaCa-2和L3.6 pl细胞的TA值分别为68.2（48小时）和51.8（72小时），单位为μM。IC50Cur值低于TA、MIA-PaCa-2:11.62（48小时）、10.03（72小时）；L3.6pl:9.4（48小时），8.9（72小时）。当与TA+Cur联合检测时，PC细胞生长受到明显抑制。在治疗后48小时，这种组合导致PC细胞生长抑制增加一倍以上().
TA和Cur对PC生长的抗增殖作用（A） 用DMSO（对照）或TA（25–100μM）或Cur（5–25μM）处理L3.6 pl和（B）MIA PaCa-2细胞，并在24、48和72小时后使用CellTiter-Glo试剂盒测量细胞活力。在治疗后24和48小时测定Cur（7.5μM）和TA（50μM）的联合作用。条形图表示归一化为对照的活细胞百分比（平均值±SEM）。所有处理均一式三份，标有“*”的条与相应的对照组有显著差异(第页<0.05).
为了评估TA的特异性，还测试了另外两种非甾体抗炎药布洛芬和塞来贝来的抗增殖作用。有趣的是，布洛芬对高达100μM的PC细胞没有显示出抗增殖作用，与Cur联合使用也没有益处(). 西乐葆（单独使用或与Cur联合使用）引起的细胞生长抑制与TA相当，表现出剂量/时间依赖性反应。因为，众所周知非甾体抗炎药会引起心脏毒性；使用心肌细胞（H9C2细胞）测试TA和西乐葆的细胞毒性。TA在50μM时无毒性，但在100μM时抑制约20%的细胞生长；然而，在50和100μM剂量下，西乐葆分别抑制>25%和90%的生长。
Ibu和Cel对PC细胞增殖的影响（A） 用载体（对照）或Ibu（25、50和100μM）处理L3.6 pl和MIA PaCa-2细胞，并在处理后24和48小时测定细胞活力。（B） L3.6pl和MIA-PaCa-2（D）细胞用载体（对照）或Ibu（50μM）或Cur（7.5μM）或两者处理，并在24小时和48小时测定细胞活力。条形图（与对照相比的活力%）表示三次测定的平均值±SEM。“*”表示与相应控件有显著差异(第页<0.05). （C） L3.6 pl和MIA PaCa-2细胞用载体（对照）、50μM TA或Cel、7.5μM Cur、TA+Cur、Cel+Cur处理。（D） H9C2细胞用载体、50μM TA或Cel或100μM TA和Cel处理。在治疗后48小时测量细胞活力。显示的数据表明，%的活细胞高于对照组。条形代表平均值±SEM（n=3）。在C和D中，除标有“#”的条外，所有值都与相应的控件有显著差异(第页<0.05).
为了确定TA-Cur相互作用的潜在机制，使用Chou-Talalay药物相互作用中位数效应分析计算组合指数（CI）值[33]. 使用CalcuSyn软件（英国剑桥Biosoft）计算CI值。CI值小于1.0表示交互中的协同作用。如中所示L3.6 pl的CI值小于1.0，MIA-PaCa-2的CI值大于1.0，表明TA和Cur联合对L3.6 pl-细胞的活力具有协同抑制作用，但对MIA-PaCa-2细胞的活力没有协同抑制作用。
TA和Cur联合抑制Sp蛋白和survivin的表达，上调凋亡标记物c-PARP的表达和caspase 3/7的活性（A） 组合指数：接种在96周板中的PC细胞用不同浓度的TA和Cur（TA:Cur比为50:7.5）处理48小时。用CellTiter-Glo试剂在48h测定细胞生长。根据Chou和Talalay的方法，使用CalcuSyn软件，使用细胞活力数据计算组合指数（CI）。计算不同效应水平下的CI值，用TA（50μM）或Cur（7.5μM）处理ED50、ED75和ED90（B）PC细胞48小时，并制备蛋白提取物。Western blot分析测定Sp1、Sp3、survivin、c-PARP和β-肌动蛋白（负荷控制）的表达。（C） 用载体（对照）或TA（50μM）或Cur（7.5μM）处理L3.6 pl和MIA PaCa-2细胞48小时，或两者同时处理。使用Caspase-Glo 3/7试剂盒测量Caspase 3/7水平。与对照组（n=3）相比，条形图显示（平均值±SEM）增加了%。标有星号的条与相应的控件有显著差异(第页<0.05).
3.2 Cur+TA联合抑制Sp1、Sp3和survivin表达
用TA（50μM）和Cur（7.5μM）处理PC细胞48小时。制备蛋白质提取物，通过Western blot分析测定Sp1、Sp3、survivin和β-actin（负荷控制）的表达。TA降低了Sp1和Sp3的表达，同时两种细胞系中survivin的表达也有类似的降低(); 然而，Cur没有显示任何效果。值得注意的是，Cur+TA处理增加了对Sp蛋白的抑制。Sp蛋白（表达）的变化与PC细胞生长抑制相一致。
3.3 Cur和TA联合诱导细胞凋亡
效应半胱天冬酶在凋亡途径中的作用已得到充分证实。Cur和TA引起剂量依赖性反应并诱导caspase-3/7活性。虽然TA或Cur导致约2倍的增加，但这两种组合在两种细胞系中都增加了4倍(). 为了表征与TA诱导的细胞凋亡相关的分子标记，在治疗后48小时评估裂解PARP的表达。通过Western blot分析测定促凋亡标记c-PARP的表达。TA上调PARP的断裂；Cur+TA的作用更为显著().
使用流式细胞术进一步测定Cur+TA对PC细胞凋亡的影响。如Annexin-V染色所示()TA（50μM）、Cur（7.5μM）或联合治疗导致细胞凋亡显著增加。L3.6pl中的凋亡细胞百分比随每种治疗而增加，但Cur+TA联合治疗（Con:5.25%；TA:22.7%；Cur:7.21%；TA+Cur:65%）和MIA PaCa-2（Con:7.98%；TA:13.7%；Cur:0.58；TA+Cu:26.2%）更有效。
TA和Cur治疗增加PC细胞的凋亡细胞数量（A） 用DMSO（对照）或TA（50μM）或Cur（7.5μM）或者TA+Cur处理L3.6 pl和（B）MIA PaCa-2细胞48小时。用流式细胞术用Annexin-V染色评估凋亡细胞群，并用FlowJo软件分析数据。
3.4 Cur和TA增加ROS水平
测定了Cur和TA对PC细胞ROS的个体效应和联合效应。在治疗后24小时，测定TA、Cur和TA+Cur诱导ROS的效果。在L3.6 pl细胞中，Cur和Cur+TA导致ROS水平分别增加2倍和3倍；然而，对MIA PaCa-2细胞的影响很小(). 这些结果表明，Cur单独或与TA联合诱导L3.6pl细胞中的ROS。
TA和Cur对PC细胞活性氧水平的影响（A） L3.6 pl和（B）MIA PaCa-2细胞在TA（50μM）或Cur（7.5μM）存在或TA+Cur的组合存在下培养。24小时后，使用CM-H2DCFDA试剂盒（Invitrogen）通过流式细胞仪测定ROS水平。使用FlowJo软件对结果进行处理。
3.5 Cur和TA抑制NF-kB易位
测试TA和/或Cur处理对NF-kB转位到细胞核的影响。用TNFα处理细胞，诱导NF-kB易位。通过免疫荧光评估NF-kB从细胞质到细胞核的易位。如中所示与两种细胞系中所有处理组的细胞质相比，细胞核NF-kB染色强度明显降低。与单一（TA或Cur）药物处理的细胞相比，TA+Cur处理的细胞对NF-kB易位的抑制更高。
TA和Cur对PC细胞NF-kB易位的影响（A） MIA PaCa-2和（B）L3.6 pl细胞在载体（对照）或TNFα（15 ng/ml）存在下培养，并用TA（50μM）或Cur（7.5μM）或者TA+Cur处理。通过免疫荧光检测细胞以评估NF-kB（进入细胞核）的易位。使用垂直荧光显微镜（奥林巴斯AX70）拍摄图像（60X）。代表性图片如图所示。Con:Control；TA：甲苯磺酸（50μM）；Cur：姜黄素（7.5μM）；TA+CUR：托芬那酸和姜黄素。
3.6 Cur+TA组合调节细胞周期相位分布
TA和Cur的联合使用增加了细胞生长抑制(). 由于仅仅诱导细胞凋亡可能无法解释这种反应，因此还使用流式细胞术评估了其对细胞周期阻滞的影响(). 在L3.6细胞中，TA引起早期（G1)停搏（Con:38.6%；TA:52.8%），Cur在G细胞中积累更多细胞2阶段（Con:16.9%；Cur:21.8%），而TA和Cur的组合显示两种G中的细胞都有所增加1和G2阶段，但“S”阶段的百分比始终较低(). 在MIA PaC-2细胞中，TA导致G1期阻滞（Con:59.7%；TA:74.4%），而Cur处理导致G2期细胞轻微堆积（Con:29.0%；Cur:34.8%）。联合治疗显示G的边际反应1细胞周期的“S”期(). 这些结果表明，细胞周期阻滞可能是细胞生长抑制的部分原因。
TA和Cur对PC细胞周期的影响在DMSO（对照）、TA（50μM）、Cur（7.5μM）或TA+Cur存在下培养人PC细胞（A）L3.6 pl和（B）MIA PaCa-2 48 h。通过流式细胞术测量细胞周期相分布。图中显示了具有代表性的直方图（带峰值）。
4.讨论
胰腺癌是癌症相关死亡的第四大常见原因，美国国家癌症研究所（NCI）估计，仅在美国一年内，就将发生43140例胰腺癌新病例和36800例死亡[34]. 这种恶性肿瘤的预后很差，5年生存率低于5%。虽然PC的主要分子变化包括包括抑癌基因在内的几个癌基因的突变和失活，这种恶性肿瘤的侵袭性与生长因子及其受体的扰动有关，这些因子及其受体影响参与生长和分化控制的下游信号转导途径[35,36]. 人们越来越感兴趣的是，寻找能够对抗特定靶点的新型药物，这些靶点与推动癌细胞生长和存活有关。转录因子（Sp蛋白，NF-kB）可能是PC治疗干预的潜在靶点。
在本研究中，我们研究了一种使用小分子和Sp抑制剂（TA）以及具有治疗特性的天然产物（Cur）的组合来诱导PC细胞治疗效果的策略(). 为了验证这种疗效是否针对这种特定的组合，我们使用布洛芬和西乐葆这两种非甾体抗炎药测试了其他组合(). 布洛芬是一种常见的非甾体抗炎药，主要用于治疗轻度疼痛和发烧，已知其副作用相对较好。布洛芬在PC细胞中没有显示出抗增殖作用。西乐葆已在一些癌症的临床试验中进行了测试(https://clinicaltrials.gov网站). 在这项研究中，结果表明西乐葆在剂量曲线或联合治疗中引起PC细胞生长抑制，与TA相似()但与TA相比，在H9C2心肌细胞中显示出显著的细胞毒性（100μM剂量下约为TA的4倍），这表明TA可能比西乐葆引起的心脏副作用更低。这些结果进一步证明了在这种联合治疗中测试TA的原因。
涉及植物化学物质的联合治疗已显示出抑制癌细胞生长的有益反应[37]. 胃肠组织中的细胞凋亡有几种机制[38]. 细胞凋亡可能通过外源性和内源性途径发生，但这两种途径都集中于效应半胱天冬酶3/7[39]. 在本研究中，结果显示c-PARP的表达增加()，凋亡细胞群()和效应半胱天冬酶3/7的激活(). 此外，Cur+TA的结合也上调了L3.6 pl细胞中的ROS(). 从Annexin-V染色可以明显看出，L3.6 pl细胞的凋亡率远高于MIA-PaCa-2细胞。高水平的活性氧可通过激活凋亡途径导致细胞死亡。这些结果与组合指数分析一致，表明TA+Cur组合对细胞活力的影响仅在L3.6 pl细胞中是协同的().
TA和Cur+TA组合的抗增殖作用伴随着Sp1、Sp3和survivin蛋白表达的显著降低(). Sp蛋白调节与癌症相关的细胞过程（如细胞凋亡和细胞周期停滞）中至关重要的基因[40,41]. TA靶向介导survivin表达的Sp1和Sp3转录因子[42]. Survivin是凋亡蛋白的抑制剂，介导凋亡、细胞分裂和诱导有丝分裂[39,43,44]. survivin的抑制可能部分促进了caspases3/7的激活().
诱导活性氧达到高水平被认为是癌症治疗的一种治疗策略，然而活性氧也在癌症的发生中起作用。早期研究表明，Cur和TA能够增加癌细胞中的ROS[45,46]. 我们的结果表明，与单药治疗相比，TA和Cur联合治疗导致ROS水平升高(). L3.6pl对ROS的诱导作用更高，而MiaPaCa-2细胞则略有增加。事实上，与联合治疗后的MIA-PaCa-2细胞相比，L3.6pl细胞中凋亡细胞的百分比要高得多(). 活性氧可导致DNA损伤和随后的细胞死亡；因此，它可能是导致L3.6pl细胞死亡的原因。众所周知，活性氧可以影响肿瘤的发生，但在较高水平上，它会抑制癌细胞和肿瘤生长。研究表明，Cur和TA均能增加L3.6pl细胞中的ROS水平。两个Cur[45]和TA[46]已知通过调节转录因子产生活性氧并导致随后的DNA损伤[46]和/或microRNA（miR-27a和miR-20a）[45]. 由于这两种药物都可以诱导ROS，因此组合可以进一步增强易感细胞的这种反应。目前的结果表明，由于Cur和TA的结合，ROS的增加在诱导L3.6pl细胞的抗增殖作用中起着重要作用。
转录因子NF-κB调节与炎症、血管生成、凋亡、细胞生长和侵袭相关的基因[47]. 本研究结果表明，TA+Cur联合抑制NF-kB向细胞核的移位(). 众所周知，在一些癌症模型中，Cur和TA调节NF-κB信号传导[48,49]. 这些结果表明，TA可能有助于诱导Cur抑制NF-kB易位的作用，与这两种药物的联合治疗至少部分有效，这是由于NF-kB相关信号的调节。我们的结果还表明，TA可导致L3.6 pl和MIA PaCa-2细胞的细胞周期阻滞。流式细胞术分析()表明TA处理导致G细胞的积累0/G公司1两种细胞系的相。TA+Cur联合治疗MIA PaCa-2细胞0/G公司1也影响DNA合成期（S）。在L3.6 pl细胞中，每种药物都表现出高反应，表现出多阶段的作用（DNA合成低和G细胞阻滞2/M） ●●●●。由于该组合影响细胞周期的多个阶段，因此也可能导致PC细胞生长抑制。
总之，本研究表明，食用香料Cur和小分子TA的组合通过诱导凋亡和导致细胞周期阻滞来抑制PC细胞的生长。TA和TA+Cur组合的抗增殖作用伴随着Sp1、Sp3和survivin表达的显著降低，ROS的诱导和NF-kB易位的抑制。在两种细胞系中，L3.6 pl细胞对单一药物或联合治疗表现出较高的敏感性。TA+Cur联合使用对L3.6 pl细胞的生长抑制作用高于MIA PaCa-2细胞。这种反应伴随着多种过程的调节，包括细胞凋亡和细胞周期。与MIA-PaCa-2相比，L3.6pl细胞中凋亡标记物（c-PARP，caspase 3/7）和ROS的诱导以及细胞周期阻滞更为明显。先前曾报道过ROS和NF-kB在调节信号级联和诱导胰腺癌化疗不良反应中的相关性[50,51]，Cur+TA的联合作用影响ROS和NF-kB，从而在PC细胞中诱导更高的疗效。总的来说，这些结果表明，抑制Sp蛋白和NF-kB信号主要与这种组合的有益作用有关。尽管对Cur和TA的研究报告了其在多种癌症中的抗癌活性，但这是第一项测试这两种药物联合增强PC细胞抗增殖作用的研究。与目前用于胰腺癌的标准细胞毒疗法相比，这种治疗策略具有良好的活性和更好的耐受性。当前[48]和TA[52]已经（单独）测试了它们的化学预防特性，并且这两种药物在动物模型中均显示出阳性反应。Cur在一项临床研究中表现出癌症预防作用。IIa期临床试验表明，Cur可有效减少异常隐窝病灶的形成，为预防结肠肿瘤提供了证据[53]. 因此，除了治疗应用外，这种组合可能在未来进行测试，以重点关注其化学预防性能。
致谢
这项工作得到了雪莉·E·诺兰基金会（授予RB）、UNTHSC癌症研究和临床前服务研究所（RB&JS）的部分资助。JKV由国家卫生研究院少数民族健康和健康差异研究所的拨款（1P20 MD006882）资助。
脚注
利益冲突
未申报。
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