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国际临床实验医学杂志。2015年;8(2): 1737–1746.
2015年2月15日在线发布。
预防性维修识别码:项目经理4402749
PMID:25932102

翼状胬肉苯乙烯减轻缺血再灌注大鼠心脏炎症反应:TLR4/NF-κB信号通路的作用

摘要

目的:在大鼠心脏缺血/再灌注损伤模型中,本研究的目的是探讨蝶啶是否能调节TLR4/NF-κB信号转导,减少中性粒细胞的蓄积和TNF-α的诱导。材料与方法:大鼠随机暴露于假手术、心肌缺血再灌注(MI/R)、MI/R+蝶啶、MI/R+蝶啶+L-NAME。检测心肌梗死面积、细胞凋亡、TLR4表达、NF-κB表达、MPO水平和TNF-α水平。结果:心肌缺血再灌注后,缺血区心肌TLR4、NF-κB和caspase-3的表达显著增加。与MI/R相比,翼冬烯显著减弱TLR4、NF-κB和caspase-3的表达。此外,它还降低了髓过氧化物酶(MPO)水平、血清和心肌TNF-α的产生、心肌梗死面积(INF/AAR%)和MI/R诱导的心肌细胞凋亡。结论:这些数据提供了证据表明,翼手龙抑制心肌梗死/再灌注大鼠心脏TLR4/NF-κB信号转导和凋亡,这与NO的产生有关。

关键词:二苯乙烯、缺血/再灌注损伤、细胞凋亡、TLR4/NF-κB信号传导、中性粒细胞、TNF-α

介绍

缺血/再灌注引起的炎症反应是心肌缺血再灌注损伤中最重要的环节之一[1]. 在炎症过程中,会释放多种细胞因子,包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)和白介素8等[2]. TNF-α可触发心肌缺血再灌注引起的炎症反应。此外,炎症还包括血管内皮细胞损伤和由细胞因子和粘附分子激活的炎性细胞,如中性粒细胞。因此,TNF-α活性和中性粒细胞浸润量可以作为炎症反应的指标。此外,已经证明TLR4/NF-κB信号在心肌梗死/再灌注期间被激活,进而导致TNF-α的诱导,而TNF-[34].

TLR是在先天免疫中起关键作用的分子家族[56]. 相应TLR的激活触发炎症反应,提醒宿主微生物入侵并启动免疫反应。最近的研究表明,一些TLR家族成员还提醒宿主组织损伤的存在,并被受损组织释放的内源性分子激活[78]. 此外,硫酸乙酰肝素、透明质酸和其他内源性分子已被证明通过TLR4启动炎症途径[9-11]. 研究还表明,TLR4介导的信号转导在心肌梗死/再灌注期间诱导心肌功能障碍[12].

Pterostilbene(反式-3,5-二甲氧基-4-羟基二苯乙烯,Pte)是一种天然衍生化合物,主要存在于蓝莓和Pterocarpus marsupium心材中[1314]. 它的结构与白藜芦醇相似,白藜芦醇是一种在红葡萄酒中发现的化合物,具有类似的抗氧化、抗炎和抗癌特性;然而,由于两个甲氧基的存在,翼手龙表现出更高的生物利用度,这导致其亲脂性和口服吸收增加[15-17]. 大量证据表明,翼替尼在包括神经、代谢和血液系统疾病在内的多种人类疾病中可能具有许多预防和治疗特性[18]. 临床前试验中报道了翼冬烯的进一步益处,其中翼冬烯被证明是几种恶性肿瘤的有效抗癌剂[19]. 虽然先前的研究表明铂族元素具有抗炎作用,但其在炎症中的作用尚不清楚。因此,本研究旨在研究TLR4/NF-κB信号通路在大鼠心肌缺血再灌注(MI/R)模型中Pte抗炎作用中的作用。

材料和方法

试剂

Pte购自中国上海迪白化学公司。MPO检测试剂盒购自建城生物工程研究所(中国南京)。TNF-αELISA试剂盒购自美国R&D公司。L-NAME购自Sigma Chemical Co.(美国密苏里州圣路易斯)。BCA蛋白定量试剂盒购自Bio-Read(美国)。NF-κB p65兔多克隆(ab16502)购自美国Abcam。抗TLR4抗体(ab13556)和山羊抗兔IgG购自美国Abcam。Bcl2,Caspase3抗体购自美国细胞信号公司。

EnVison+购自Gene Tech(中国)。细胞死亡检测试剂盒购自德国罗氏分子生物化学公司。

动物

40只成年雄性Sprague-Dawley大鼠(250-300 g)购自中国山东大学实验动物中心。本研究中使用的所有动物均按照美国国立卫生研究所出版的《实验动物护理和使用指南》(NIH出版物编号85-23,1996年修订)进行护理,所有程序均经第四军医大学实验动物委员会批准。

心肌缺血再灌注模型及实验方案

雄性Sprague-Dawley大鼠(250-300 g)用戊巴比妥钠腹腔麻醉(美国圣路易斯西格玛,40 mg/kg)。通过左胸切口将心脏外部切开,然后在左冠状动脉前降支(LAD)周围打结(5-0丝),可产生心肌缺血。缺血30分钟后,解开滑结,再灌注120分钟。

大鼠被随机分为四个实验组。每组10只大鼠:(1)假手术组:在LAD下方钻取蚕丝,但LAD未结扎;(2) MI/R组:结扎LAD 30min,然后用接受载体(0.9%NaCl静脉注射)再灌注120min;(3) MI/R+Pet组:再灌注前5min给予Pte(100μmol/L,静脉注射);(4) MI/R+Pte+L-NAME组:在再灌注前20分钟给予一氧化氮合酶抑制剂L-NAME(1 mmol/L,静脉注射)。给药L-NAME后15分钟,静脉注射Pte(100μmol/L)。

心肌梗死面积测定

每个接受治疗的心脏都被迅速切除,并沿着长轴连续切片成六片。该步骤之后,在37°C的1%TTC中孵育10分钟,以划分存活和不存活心肌。对6块心肌切片分别称重。一名对方案一无所知的观察者使用计算机辅助平面测量法评估了梗死面积的百分比(OPTIMAS v5.2)。

心肌细胞凋亡的测定

在再灌注结束时,使用原位细胞死亡检测试剂盒,通过末端脱氧核糖核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记分析(TUNEL)分析心肌细胞凋亡。简言之,采用双重染色技术,TUNEL染色用于凋亡细胞核,4,6-二氨基-2-苯吲哚(DAPI)染色用于所有心肌细胞核,如前所述[20]. 凋亡指数以阳性染色的凋亡心肌细胞数/计数的心肌细胞总数×100%表示。

心肌TLR4表达的免疫组织化学分析

在免疫组织化学检查之前,将预处理心肌组织的3μm切片置于3%H的沐浴液中2O(运行)2和60%甲醇PBS处理30分钟,然后在95°C的微波炉中用0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液处理13分钟(抗原回收)。此后,用PBS中的5%正常山羊血清和5%牛血清白蛋白处理标本。在每个步骤之前,在PBS缓冲液中冲洗切片三次。在基于PBS的1%牛血清白蛋白溶液中,在4°C的推荐稀释液中,用主要抗TLR4抗体孵育12小时。用PBS冲洗后,将切片与相应的次级生物素化山羊抗兔抗体EnVison+在室温下孵育1小时。然后将链霉亲和素/辣根过氧化物酶复合物用作检测系统(1:100稀释液),持续1h。最后,在0.05mol/L Tris-HCl缓冲液和0.1%h中用3,3-二氨基联苯胺四氢氯化物进行染色2O(运行)2。阴性对照切片在没有一级抗体的情况下培养。本研究中的所有数据均通过软件“Image Pro Plus”(Media Control Corporation,DC)进行分析。

心肌NF-κB、Bcl-2和caspase-3表达的Western blotting分析

在再灌注期结束时,制备蛋白质样品。简言之,在含有50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.3)、150 mmol/L-NaCl、5 mmol/L-EDTA、1 mmol/L-二硫苏糖醇、1%Triton X-100和1%蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液中使心脏组织均匀化。将裂解产物在12000×g下离心15 min,将所得上清液转移到新试管中并保存在-70°C下。使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度,通过电泳分离蛋白质并转移到硝化纤维素膜。在含有5%非脂肪干乳的Tris缓冲盐水和吐温20(TBST,pH 7.6)中封闭细胞膜1小时,然后在4°C下用NF-κB抗体(1:500稀释)、Bcl-2抗体(1:1000稀释)和caspase-3抗体(1:11000稀释)孵育过夜,然后用TBST冲洗。然后在室温下用山羊抗兔IgG二级抗体(1:5000稀释液)对膜进行90分钟的检测,然后用TBST洗涤。用ECL-Plus试剂对印迹进行可视化,并使用Quantity One软件包(英国Bio-Read Laboratories)进行量化。

髓过氧化物酶(MPO)水平的测定

再灌注后,将心肌组织置于-70°C保存。根据制造商的说明,使用MPO检测试剂盒检测心肌组织中MPO的水平。

TNF-α水平的检测

再灌注后,严格按照制造商的说明检测心肌组织匀浆和血清中的TNF-α水平。用BCA试剂盒检测蛋白质定量。

统计分析

数据以平均值±SEM表示。在进行单向方差分析(ANOVA)之前,通过Student t检验对未配对数据进行评估,或通过Dunnett t检验对多重比较进行评估。对于所有测试,P(P)<0.05被认为具有统计学意义。

结果

翼状胬肉苯乙烯减少心肌梗死/再灌注引起的心肌梗死面积

心肌梗死/再灌注导致明显的梗死面积。与心肌梗死/再灌注组相比,pterostilbene显著减少了心肌梗死面积。一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NAME阻断了蝶啶的作用(图1).

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各组心肌梗死面积的比较。A: 不同处理组大鼠心室样本的代表性TTC染色;B: 心肌梗死面积的定量分析(INF/AAR%)*P(P)<0.05 vs.Sham#P(P)<0.05 vs.MI/R$P(P)<0.05 vs.MI/R+Pte.Sham:假手术组;MI/R:MI/R组;MI/R+Pte:MI/R+蝶啶组;MI/R+Pte+L-NAME:MI/R+蝶啶+L-NAME组,每组n=10。

翼状胬肉苯乙烯降低心肌缺血/再灌注后心肌细胞凋亡

假手术组TUNEL阳性染色水平很低。在MI/R组中观察到显著数量的TUNEL阳性细胞。服用替罗替宾具有显著的抗凋亡作用,但L-NAME已将其消除(图2).

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凋亡论文。A: TUNEL染色;B: 心肌细胞凋亡百分比的定量分析*P(P)<0.05 vs.Sham#P(P)<0.05 vs.MI/R$P(P)<0.05 vs.MI/R+Pte.Sham:假手术组;MI/R:MI/R组;MI/R+Pte:MI/R+蝶啶组;MI/R+Pte+L-NAME:MI/R+蝶啶+L-NAME组,每组n=10。

翼状胬肉苯乙烯降低心肌缺血/再灌注心脏TLR4蛋白表达

在MI/R组,免疫组化分析显示TLR4的表达与假手术组相比显著增加。在给药蝶窦替宾后,TLR4的表达显著降低,而L-NAME可消除TLR4的表达(图3).

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心肌TLR4表达的免疫组织化学分析。TLR4呈棕色染色。假手术组;MI/R:MI/R组;MI/R+Pte:MI/R+蝶啶组;MI/R+Pte+L-NAME组:MI/R+pterostilbene+L-NAME组,每组n=10。

Pterostilbene降低MI/R心脏NF-κB的表达

为了进一步研究翼手龙对TLR4介导的信号转导的影响,测定了TLR4下游分子NF-κB。Western blotting结果显示,MI/R组NF-κB表达上调。服用翼冬烯可显著降低NF-κB的表达,L-NAME可消除翼冬烯的作用(图4).

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翼冬烯对NF-κB表达的影响。A: Western blot检测NF-κB的表达。B: NF-κB的定量分析*P(P)<0.05 vs.Sham#P(P)<0.05 vs.MI/R$P(P)<0.05 vs.MI/R+Pte.Sham:假手术组;MI/R:MI/R组;MI/R+Pte:MI/R+蝶啶组;MI/R+Pte+L-NAME组:MI/R+pterostilbene+L-NAME组,每组n=10。

翼冬烯对心肌梗死/再灌注患者Bcl2和Caspase3表达的影响

MI/R显著降低Bcl-2的表达(P(P)< 0.05). 然而,翼冬烯增加了Bcl-2的表达(P(P)<0.05),被L-NAME废除(P(P)< 0.05). 相反,MI/R显著增加caspase-3的表达(P(P)< 0.05). 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的表达被翼冬烯治疗降低(P(P)<0.05),被L-NAME阻断(P(P)< 0.05) (图5).

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翼冬烯对MI/R中Bcl-2和caspase-3表达的影响。Western blot检测A:Bcl-2及caspase-2表达。B: 定量分析Bcl-2和caspase-3的表达*P(P)<0.05 vs.Sham#P(P)<0.05 vs.MI/R$P(P)<0.05 vs.MI/R+Pte.Sham:假手术组;MI/R:MI/R组;MI/R+Pte:MI/R+蝶啶组;MI/R+Pte+L-NAME:MI/R+蝶啶+L-NAME组,每组n=10。

翼状胬肉抑制MI/R组织中性粒细胞浸润

中性粒细胞含有一定量的髓过氧化物酶(MPO),占干细胞重量的5%。因此,心肌中MPO的活性可以作为中性粒细胞浸润的指标。如所示图6假手术组MPO活性相对较低,而MI/R组MPO活力显著升高。翼手龙显著降低心肌MPO活性,而L-NAME减弱翼手龙的作用。

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各组MPO活性的比较。与MI/R组相比,MI/R+Pte组MPO活性显著降低。L-NAME消除了翼手龙的影响*P(P)与MI/R组相比<0.05#P(P)与MI/R+Pte组相比,<0.05。假手术组;MI/R:MI/R组;MI/R+Pte:MI/R+蝶啶组;MI/R+Pte+L-NAME:MI/R+蝶啶+L-NAME组,每组n=10。

翼手龙降低血清和心肌梗死/再灌注组织中的TNF-α水平

心肌梗死/再灌注损伤导致大量TNF-α的产生。因此,检测了心肌和血清TNF-α水平。图7与MI/R组相比,翼冬烯显著降低心肌和血清中的TNF-α水平,而L-NAME可消除该水平。

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各组心肌和血清TNF-α水平的比较。与MI/R组相比,翼冬烯显著降低TNF-α水平。L-NAME消除了翼手龙的作用*P(P)与MI/R组相比<0.05#P(P)与MI/R+Res组相比,<0.05。假手术组;MI/R:MI/R组;MI/R+Pte:MI/R+蝶啶组;MI/R+Pte+L-NAME:MI/R+蝶啶+L-NAME组,每组n=10。

讨论

本研究的主要发现是:(1)Pte通过抑制TLR4/NF-κB信号通路,减轻I/R损伤诱导的炎症反应。(2) Pte通过抑制中性粒细胞浸润和TNF-α的产生,减轻I/R损伤引起的炎症反应。(3) NO可能在Pte的保护作用中起重要作用。

炎症反应在心肌缺血/再灌注损伤中起着重要作用(1)。炎症细胞因子的释放以及炎症细胞的聚集和浸润是炎症的关键步骤[21].

TNF-α主要由巨噬细胞分泌,可能通过增加其他促炎细胞因子的释放和影响中性粒细胞的募集来促进炎症级联反应[22]. TNF-α作为炎症反应中的一种重要细胞因子,在MI/R诱导的炎症反应中起着重要的启动作用[3]. TNF-α可以诱导其他炎症介质的释放,增加细胞粘附因子的表达,促进中性粒细胞与内皮细胞的粘附。此外,TNF-α具有负性肌力作用,可以抑制心肌收缩,降低血压。TNF-α还可诱导心肌细胞凋亡并参与心室重塑[23]. 以往研究表明,心肌梗死/再灌注后TNF-α水平显著升高[24]而给予TNF-α单克隆抗体可减轻水肿,有利于心功能恢复[25].

MI/R损伤似乎部分是由中性粒细胞激活引起的。潜在机制包括:(1)释放氧自由基、蛋白水解酶和细胞毒性物质导致的细胞损伤。(2) 释放的炎症介质导致血管内皮细胞损伤、血管通透性增加和水肿。(3) 炎症细胞的进一步激活进一步增加炎症反应[26]. (4) 中性粒细胞粘附于血管内皮和小血管闭塞导致无血流现象。以前的研究已经证明中性粒细胞与缺血/再灌注损伤之间的联系。去除中性粒细胞或药物抑制中性粒细胞活性已被证明可减少缺血/再灌注损伤[2728]. 在本研究中,我们发现MI/R组中性粒细胞的积累和TNF-α的产生显著增加。并且,翼冬烯可减少中性粒细胞的积累和TNF-α的生成,这表明翼冬烯抑制中性粒细胞积累和TNFα的产生,从而减轻中性粒细胞介导的缺血/再灌注损伤。

TLR存在于免疫细胞和非免疫细胞中,它们的表达在对病原体、细胞因子和环境应激源的反应中迅速改变[29]. TLR,尤其是TLR4的作用与多种心血管疾病的发生、NF-κB和炎症细胞因子(如TNF-α)的激活有关,并导致细胞死亡[3031]. TLR4在包括心脏在内的许多组织中正常表达,受体在缺血反应中上调。LPS或IL-1增强心肌细胞TLR4的表达水平[32]. TLR4介导的信号传导已得到很好的证实,据了解,TLR4的上调导致心肌细胞NF-κB的激活。这可以增加包括TNF-α、IL-1和MCF在内的细胞因子的释放以及白细胞的浸润[33].

据信,NO与MI/R诱导的炎症密切相关[34]. 内皮衍生NO可以抑制细胞粘附因子,如P-选择素和ICAM-1水平,从而抑制白细胞粘附和向内膜迁移[35]. 内皮源性NO还可以抑制TNF-α和其他促炎因子的表达。它还可以提高IL-10和其他抗炎因子的水平,并间接抑制炎症细胞聚集到局部炎症,从而减少炎症反应[36]. 在本研究中,当添加一氧化氮合酶抑制剂L-NAME时,Pte的保护作用被取消,表明NO在Pte的防护作用中起着关键作用。

综上所述,本研究表明,翼冬烯通过TLR4/NF-κB信号通路减轻心肌缺血/再灌注损伤诱导的炎症反应,并且翼冬烯减少心肌缺血/复灌损伤诱导的细胞凋亡。翼冬烯的保护作用与NO生成的增加、中性粒细胞浸润和TNF-α生成的抑制密切相关。

致谢

本研究得到了山东大学自主创新基金(IIFSDU,编号:2012TS171)和山东省杰出青年科学家研究奖基金(编号:2006BS03014)的资助。

利益冲突的披露

没有。

工具书类

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文章来自国际临床与实验医学杂志由提供电子世纪出版公司