突变诱导的多能干细胞系再现了TDP-43蛋白病的各个方面，并揭示了细胞特异性脆弱性

摘要

抗去污剂反式反应DNA-结合（TDP-43）的细胞质积聚是散发性和遗传性FTLD-TDP（额颞叶变性的一个亚群）和ALS的病理特征[超氧化物歧化酶1（SOD1）除外，并在肉瘤（FUS）病例中融合]，并提示一种共同的病理机制(1——4). 编码TDP-43的基因突变(TARDBP公司)已在家族性和散发性ALS中发现(5——8). 一些体外和体内模型确定了ALS-相关TDP-43突变的毒性，但其潜在机制尚不清楚(9,10). ALS和FTLD-TDP发病机制的大多数细胞和动物模型都涉及TDP-43在非神经元或非人类细胞中的过度表达，不能用于研究神经元的选择性脆弱性或人类细胞特有的关键分子事件。相比之下，诱导多能干细胞（iPSCs）(11——14)结合明确的体外分化方案(15——20)提供一个模型系统，在更生理学的背景下研究疾病机制。在这里，我们报告了携带M337V突变的ALS患者iPSC-derived人类神经元内源性突变TDP-43的病理效应。

结果

从TDP-43 M337V成纤维细胞生成iPSC。

iPSC系由一名56岁ALS患者的细胞建立，该患者患有TDP-43 M337V突变(8,21)和两个健康对照组。成纤维细胞(图1A类)用编码重编程因子的逆转录病毒载体转导华侨城4号,SOX2标准,KLF4型、和c-MYC公司如参考文献所述。13扩大具有紧凑型人类ES细胞（hESC）样形态的菌落，并建立两种基因型的克隆系(图1B类). 研究中使用的所有iPSCs都表现出四种转基因沉默和内源性激活华侨城4号,SOX2标准、和KLF4型(图S1A类). 所有iPSCs均表达多能性OCT4、SOX2和TRA-1-60的蛋白标记(图1C类和D类和图S1B类)-并且具有可比较的水平华侨城4号,SOX2标准,c-MYC公司,KLF4型、和纳米表达，由定量RT-PCR（qRT-PCR）测定(图1G公司和图S1C类). 畸胎瘤形成证实了多能性(图S1D类)和亚硫酸氢盐测序华侨城4号促进剂(13) (图1F类). 通过直接测序第6外显子证实了该基因突变TARDBP公司在所有行中(图1E类). 所有克隆都保持了40多代的正常核型。

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图1。

从患者成纤维细胞建立iPSCs。(A类和B类)ALS患者的原发性皮肤成纤维细胞(A类)形成紧密堆积的hESC样集落(B类)用OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC重新编程慢病毒后。(C类和D类)无喂养患者iPSCs多能性标记物OCT4、Tra-1-60和SOX2的免疫组织化学特征。(E类)直接测序证实了患者来源的iPSC中TDP-43中的M337V突变。(F类)亚硫酸氢盐序列分析华侨城4号M337V iPSCs和人胚胎干细胞系H9s中的启动子。(G公司)M337V和WT iPSCs与人胚胎干细胞株H1、Shef4和Shef6中OCT4、KLF4、c-MYC和SOX2总表达水平的qRT-PCR比较。数值为平均值±SEM。所有结果均来自M337V iPSC克隆2（M337V-2）G公司和是iPSC克隆M337V-1的代表。

TDP-43 M337V不能阻止运动神经元的分化和功能成熟。

为了评估TDP-43 M337V突变对神经分化和功能的影响，我们从多能干细胞中产生了包含脊髓MN的尾化神经元群，如前所述(21——23). 通过双SMAD信号抑制将无饲养层iPSCs分化为神经外胚层(21) (图2A类和图S2A类). 生成的替换>90%NESTIN⁺和SOX1⁺单元格(图2B类和C类). PAX6⁺神经上皮细胞(图S2B类)用维甲酸和吗啡胺处理后生成NKX6.1标准和OLIG2⁺脊髓腹侧祖细胞(图2A类和图S2C类)分化为表达HB9、β3-微管蛋白、SMI-32和胆碱乙酰转移酶（ChAT）的MN(图2D–F型和图S2D类) (23——25). ChAT的电流钳记录⁺来自M337V和对照iPSC的MN显示河豚毒素敏感动作电位(图2G公司和H（H）). 全细胞电压钳记录显示NMDA、AMPA和GABA受体是MN的典型代表(图S2E类和F类). 成熟的MN培养物也表现出自发兴奋性突触后电流（EPSCs），这些电流被6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮（CNQX）阻断(图2我). 因此，M337V和对照iPSC株系都产生了表型和功能上可比较的MN(26——28).

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图2。

TDP-43 M337V和控制iPSC可以区分为功能性MN。在无饲料、贴壁培养条件下，通过双-SMAD信号抑制，iPSCs或hESCs被导向神经外胚层谱系。(A类)M337V iPSC下调华侨城4号和纳米神经化反应中的表达和上调谱系特异性基因SOX1标准,HOXB4型,NKX6.1标准、和OLIG2公司连续应用MN图案化因子维甲酸（RA）和嘌呤吗啡胺（P）后，按时间顺序排列。(B类)通过巢蛋白和Sox1的定量免疫组织化学染色，评估移植后的神经分化情况。(C类)M337V和对照iPSC和H9-hESCs在神经分化中表现出相似的效率。(D类和E类)在4-6周的成熟期，贴在层粘连蛋白/纤维粘连蛋白上的iPSC-derived MN祖细胞表达HB9和β3-微管蛋白(D类)以及HB9和SMI-32(E类). (F类)通过HB9的定量免疫组织化学评估，M337V和对照iPSC衍生的神经干细胞（NSCs）以相同的效率产生MNs。(G公司和H（H）)电流钳描记显示河豚毒素（TTX）敏感性动作电位对M337V注入去极化电流的反应(G公司)和WT(H（H）)MN。(G插图)进行记录的ChAT和LcY双阳性神经元。(我)从M337V培养物中记录的自发微型EPSC的样本痕迹。所有小型EPSC事件均被CNQX阻断。所有数据均来自M337V-2和Cont-2 iPSC。数值为平均值±SEM(n个= 3). （比例尺：10μm）

M337V增加可溶性和耐洗涤剂TDP-43蛋白质水平。

疾病ALS和FTLD-TDP神经组织的一个明确的生化特征是TDP-43的耐洗涤剂～43-kDa和C末端片段的积累(29). 接下来，我们检测了未分化iPSC中TDP-43的生化特征。根据qRT-PCR测定，M337V和对照iPSC株系表现出类似水平的TARDBP公司，多能性标记TERT（地形）和REX1型、和组蛋白脱乙酰酶6(HDAC6型)信使核糖核酸(图3A类)后者由TDP-43调节(30). Western blotting显示，与对照组相比，两个独立的M337V iPSC克隆在可溶部分中的全长TDP-43和耐洗涤剂部分中的C末端TDP-43片段的水平更高(图3B类). 重要的是，TDP-43片段与传统的细胞凋亡指数[裂解聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）]无关(图3B类)和膜联蛋白V/碘化丙啶分析(图3C类)] (31——33).

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图3。

M337V iPSC显示TDP-43错误累积的生化特征。(A类)M337V和控制iPSC表达类似水平的TDP-43型,REX1型,TERT（地形）、和HDAC6型，由qRT-PCR测定。(B类)无饲料iPSC裂解产物中洗涤剂可溶和不可溶部分的免疫印迹。～35 kDa的TDP-43片段富集在M337V iPSC裂解物的耐洗涤剂部分中。可溶性或不溶性TDP-43水平与PARP裂解无关。β-肌动蛋白作为负荷控制。(C类)流式细胞术检测典型的膜联蛋白V/碘化丙啶染色。膜联蛋白V和碘化丙啶阴性的细胞在M337V-2（85.6%）和Cont-2（75.3%）iPSC中的百分比相似，表明在基础条件下细胞死亡水平相当。

在建立含MN神经元群体中TDP-43的生化谱之前，我们首先验证了来源于M337V和对照2（Cont-2）的MN培养物具有可比的表达水平TARDBP公司,HB9型,ChAT公司、和HDAC6型通过qRT-PCR分析确定(图S3A类). 此外，来源于M337V和对照的MN培养物显示出相似的SMI-32百分比⁺细胞定量免疫组织化学(图S3B类)总的来说，这表明在分析点MN培养物的可比分化潜能和组成。免疫印迹分析显示，来自两个独立克隆的M337V MN培养物的可溶性和耐洗涤剂TDP-43的水平是Cont-2 MN培养液的四倍(图4A类和B类). 含MN人群中TDP-43水平的差异在Cont-1 MN培养中也很明显（参见图S3D类和第5章B类). 为了确定这一观察结果是否独立于神经元细胞类型和分化方案，我们生成了不含MNs的尾化神经元群体，并比较了来自突变或对照iPSCs的培养物中TDP-43的数量(图S4A类和B类). 同样，M337V神经元的可溶性（2.6±0.46 vs.1.0±0.13）和不溶性TDP-43水平高于对照组(图S4C类和D类).

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图4。

M337V神经元具有较高水平的可溶性和耐洗涤剂TDP-43。(A类和B类)M337V-1、M337V-2和Cont-2 MN培养物的Western blot分析。每个细胞系显示三个独立的提取。β3-管蛋白是可溶性组分的负荷控制(A类)和Ponceau S可逆膜染色(51)是耐洗涤剂组分的装载控制(B类). 利用ImageJ完成了波段信号强度的半定量分析。(A类)可溶性TDP-43水平归一化为β3-微管蛋白，Cont-2设置为1:M337V-1=3.67±0.58；M337V-2=4.54±0.01；Cont-2=1.0±0.24。M337V-1 vs.M337V-2，不显著；M337V-1与Cont-2，P（P）= 0.013; M337V-2与Cont-2，P（P）< 0.001,n个=3次独立提取。(B类)耐洗涤剂TDP-43标准化为Ponceau S，Cont-2设置为1:M337V-1=1.52±0.08；M337V-2=1.67±0.10；Cont-2=1.0±0.16。M337V-1 vs.M337V-2，不显著；M337V-1与Cont-2，P（P）= 0.04; M337V-2与Cont-2，P（P）< 0.03,n个=3次独立提取。数值为平均值±SEM。数据通过单向方差分析和事后Tukey检验进行分析。(C类和D类)SMI-32细胞核TDP-43的免疫荧光分析⁺和SM-I32⁻细胞。续2 SMI-32⁺（118.89%±2.6%）与SMI-32⁻（100%±2.9%），P（P）< 0.001,n个=每组40个细胞。(E类)M337V iPSC衍生SMI-32⁺MNs主要表现为细胞核TDP-43定位，胞体和轴突中存在颗粒染色。(F类)通过一个TDP-43 M337V SMI-32的正交视图⁺显示TDP-43（绿色）、SMI-32（红色）和DAPI（蓝色）定位的单元格。（比例尺：10μm）

接下来我们研究了TDP-43的亚细胞分布。密度分析表明，SMI-32⁺神经元的核TDP-43水平显著高于SMI-32⁻细胞（118.89%±2.6%vs.100%±2.9%，P（P）< 0.001) (图4). 然而，TDP-43的主要核定位在M337V和控制线路中没有差异(图S4C类). SMI-32中也检测到细微的颗粒细胞质染色⁺和ChAT⁺M337V神经元(图4E类和F类和图S4E类和F类).

TDP-43 M337V突变使MN具有选择性细胞脆弱性。

接下来，我们通过纵向荧光显微镜分析了M337V和对照MN在基础条件下的存活情况。为了特别关注MN，我们在前面描述的MN特异性Hb9启动子（Hb9:：GFP；图5A类) (34). GFP的量化⁺每孔神经元证实M337V和对照MN培养物之间无差异(图S5A类). 自动荧光显微镜是一种可以长时间成像数千个荧光标记神经元的技术，然后用于追踪单个神经元并确定其死亡时间。神经元死亡的标志是突然失去荧光或细胞本身溶解，这些标准已被证明与传统的细胞死亡标志物同样敏感(35,36). Kaplan–Meier生存分析用于绘制累积风险曲线，描述M337V衍生MNs和对照iPSCs的死亡风险(图5B类). 通过Cox比例风险分析计算与M337V突变相关的相对风险，证明风险比为2.76，表明M337V与对照MN相比死亡风险增加了276%。

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图5。

M337V TDP-43神经元表现出选择性脆弱性。(A类)HB9:：GFP的代表性图像⁺用于实时生存分析的神经元。(B类)含M337V-1、M337V-2、Cont-1和Cont-2 MN培养物的实时生存分析显示HB9:：GFP转染神经元的累积死亡风险。显示了来自三个独立分化实验的汇集数据(P（P）突变组和对照组之间<0.001，log-rank检验）。(C类)在用LY294002（40μM）处理48小时后，M337V来源的MN培养物和对照iPSCs的细胞毒性。每个孔共有20000 MN前体细胞以96周的形式进行电镀，并在开始治疗前允许分化4周。用FLUOstar OPTIMA平板读取器测量的荧光LDH释放用作细胞毒性的测量。释放的LDH归一化为每个井的总LDH，模拟处理样品设置为100%。每个治疗的细胞毒性百分比被确定为每个细胞系模拟治疗的一个因素。数值为平均值±SEM。数据通过单因素方差分析和事后Tukey检验进行分析*P（P）<0.05；M337V-1 vs.M337V-2，不显著；n个=3个独立实验。

接下来，我们确定M337V突变是否增加了神经元对神经元存活所需的关键信号通路拮抗作用的脆弱性(37). 用MAPK信号的选择性抑制剂U0126处理含MN的培养物；PI3K选择性抑制剂LY294002；或内质网应激源衣霉素。治疗48小时后，通过乳酸脱氢酶（LDH）释放测定神经元死亡。M337V和对照MN培养物对MAPK抑制或衣霉素的反应没有差异(图S5C类和D类). 然而，M337V突变株系1和2对LY294002的敏感性明显高于对照(图5C类)表明M337V iPSC衍生神经元对PI3K抑制具有内在敏感性。

讨论

本文描述了来自携带致病性TDP-43突变患者的人类MN中TDP-43蛋白病的iPSC模型。详细的细胞系和功能研究表明，TDP-43 M337V突变并不影响包括MN在内的神经元的功能成熟。然而，携带突变的神经元增加了可溶性和耐洗涤剂TDP-43的水平，并降低了基础条件下的存活率，这表明存在固有的脆弱性。突变神经元也比对照神经元更容易受到PI3K的抑制，PI3K是神经元中一种重要的信号通路(38). 因此，突变细胞重述了体外TDP-43蛋白病的关键方面，包括细胞自主性神经元变性和不溶性TDP-43的积累。该模型将促进机理研究、治疗靶点的确定，并最终促进ALS和FTLD-TDP治疗的发展。

TDP-43本质上易于聚集，ALS连锁突变增加了其毒性、聚集倾向和细胞质定位错误(1,三,29,39,40). 虽然TDP-43 M337V和对照神经元表达的TARDBP公司mRNA，突变体细胞的可溶性和耐洗涤剂TDP-43水平显著升高。以前，只有在等基因转化细胞系中才能观察到突变TDP-43蛋白稳定性的增加(41). 我们的研究结果表明，TDP-43蛋白水平的差异是由翻译后机制而非转录差异引起的。此外，突变蛋白似乎不会干扰拟议的用于控制TDP-43 mRNA水平的自动调节反馈机制(42,43). 位于TDP-43 C末端结构域的显性错义突变可能抑制突变蛋白的周转或限制蛋白质质量控制途径。

尽管生化检测到M337V神经元中的TDP-43水平较高，但免疫荧光密度法测定，我们没有发现核TDP-43比对照组多。然而，SMI-32⁺在体外，神经元的核TDP-43水平较高，这表明神经元亚型之间的TDP-43蛋白水平可能不同。此外，胞体和细胞过程中的点状TDP-43染色是一个一致的发现。这种染色模式与TDP-43参与RNA的核质穿梭、TDP-43与生长孢子粉体中RNA颗粒的结合以及脑干样品微粒体部分中TDP-43的存在相一致，表明TDP-43沿着轴突积极转运(44——47).

TDP-43表达的细胞和转基因模型表明，WT和突变TDP-43水平升高可能具有毒性，并且TDP-43的细胞质水平而非细胞核水平与细胞毒性相关(9,10,48). 如活MNs的纵向荧光显微镜所示，M337V突变显著增加了死亡风险，表明MNs突变具有固有的细胞自主毒性。神经健康和功能受多种信号调节，包括脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质细胞源性神经生长因子和其他通过受体酪氨酸激酶发出信号的营养因子(37). 我们证明，M337V神经元比对照神经元对PI3K抑制更敏感，但对MAPK通路抑制剂的易感性或通过衣霉素诱导内质网应激的易感性没有差异。因此，M337V突变对PI3K抑制具有特异性敏感性，突显了营养因子介导的信号在人类MN生存中的重要性。尽管大多数神经营养因子依赖MAPK/ERK和PI3K/AKT通路进行信号转导，但这些通路对细胞存活的贡献取决于神经元亚型和营养因子的组合(38). 例如，BDNF诱导的MN存活需要PI3K途径(49)而视网膜神经节细胞在BDNF依赖性生存中依赖PI3K和MAPK通路(50). 我们在此建立的体外模型的未来研究将侧重于不同神经营养因子对TDP-43 M337V神经元存活的贡献。

总之，我们的研究结果表明，患者来源的TDP-43 M337V神经元概括了TDP-43蛋白病的关键生物化学方面，并提供了证据，证明TDP-43中的M337V突变对iPSC来源的MNs有毒，使它们特别容易受到PI3K信号拮抗的影响。尽管本研究仅限于具有亚克隆和对照的单个患者系，但我们在TDP-43 iPSC系中发现了疾病特异性表型。这些线将有助于探索其他TDP-43突变和不同ALS引起突变在基础和应激范式下的致病机制。最后，我们的发现证明了患者特异性iPSC系在成人神经退行性疾病分子发病机制建模中的实用性。

材料和方法

补充材料

致谢

脚注

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