蛋白激酶C的结构基础αC端子尾部的调节

昆虫细胞PKC的表达与纯化α

携带mCer-hPKC的pBiEx1质粒α-mCit-FLAG基因是Sivaraj Sivaramakrishnan博士（明尼苏达大学）慷慨捐赠的。mCer和mCit编码mCerulean和mCitrine荧光蛋白，形成Förster共振能量转移（FRET）受体对。人和大鼠PKCαV5结构域的氨基酸序列相同，C2结构域169位（人类为Ala，大鼠为Thr）的氨基酸存在单一差异，该结构域不属于任何功能区。对于重组PKCα表达，mCer-hPKCα-mCit-FLAG序列被亚克隆到pAcGHLT-C（BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ）和pBac-1（EMD Millipore，伯灵顿，MA）矢量。将pAcGHLT-C或pBac-1质粒与ProGreen线性化杆状病毒DNA（AB载体）共转染到Sf9细胞中，生成重组杆状病毒。密度为2.5×10的Sf9细胞⁶/mL在无血清培养基中感染高滴度重组杆状病毒（Expression Systems，Davis，CA）。

细胞在27°C的悬浮液中培养，60 h后收获。将细胞颗粒重新悬浮在含有50 mM Tris-HCl的溶解缓冲液中，pH值为7.5，1 mM EGTA，1 mM-EDTA，3 mM MgCl₂、150 mM NaCl、停止蛋白酶抑制剂混合物（Thermo Scientific，Waltham，MA）、1 mM苯甲基磺酰氟和1%Triton X-100。将细胞悬浮液在4°C的营养器上轻轻混合30分钟，以完成溶解。mCer-hPKCα-使用抗FLAG M2亲和凝胶（Sigma-Aldrich）纯化mCit-FLAG。洗脱的蛋白质从低分子量污染物中进一步纯化，并在50-kDa MWCO自旋浓缩器（纽约州科宁市科宁市）上进行缓冲交换。用PepTag非放射性PKC分析试剂盒（Promega，麦迪逊，WI）。每次分析的总蛋白量为20 ng，反应体积为25μL.使用mCit的消光系数测定蛋白质浓度，ε（516纳米）=77000米⁻¹厘米⁻¹(41).

使用20 ng mCer-hPKC在1 mM 10-残基pHM肽存在下进行活性测定α-反应缓冲液中的mCit-FLAG含有20 mM HEPES（pH 7.4）、1 mM DTT、3.5 mM MgCl₂1 mM ATP和适当的PKC激活剂（如适用）。活化剂浓度为1 mM CaCl₂, 0.5μM佛波醇12,13-二丁酸酯（PDBu；Sigma-Aldrich）和1 mM大单层囊泡（LUV）。LUV由1-棕榈酰-2-油酰基组成-锡-甘油-3-磷酸胆碱（POPC），1-棕榈酰-2-油酰基-锡-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸（POPS）和1,2-二甲基嘧啶-锡-甘油（DAG），均来自Avanti Polar Lipid（Alabaster，AL）。各组分的摩尔比为POPC/POPS/DAG 65:30:5。所有反应在30°C下进行30分钟，并在95°C下淬火10分钟。使用光子计数荧光分光光度计（ISS，Champaign，IL）定量磷酸化肽的量。实验一式三份，两种独立的PKC制剂重复两次α在无活化剂测定中。结果报告为平均值±标准偏差。

稳态荧光光谱法

纯化mCer-hPKC的稳态荧光发射光谱α-mCit-FLAG蛋白在25°C下使用430 nm的激发波长和450–650 nm的检测范围在光子计数荧光光谱仪（ISS）上记录。激发和发射狭缝宽度设置为8 nm。试管涂上Sigmacote（Sigma-Aldrich），以尽量减少蛋白质在壁上的吸附。在含有20 mM HEPES的脱钙缓冲液中，在pH 7.4、100 mM KCl和5 mM的条件下制备浓度为7至50 nM的蛋白质样品β-巯基乙醇。FRET效率计算为与mCit在525 nm和mCer在475 nm的发射最大值对应的峰值强度之比。为了在不存在分子内相互作用的情况下获得mCit和mCer的参考荧光光谱，野生型mCer-hPKCα-mCit-FLAG受到内蛋白酶Lys-C（Thermo Scientific，Waltham，MA）的有限蛋白水解，使荧光蛋白保持完整。反应在30°C下以20:1（w/w）的蛋白质/Lys-C比率进行。在反应开始30分钟后获得荧光光谱。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳验证了裂解反应的完整性。

NMR检测到配体与C2的结合

通过添加等分浓缩pHM15（或Ca）进行配体结合实验²⁺)apo和Ca的储备溶液²⁺-绑定（或apo和pHM15-绑定）[U-¹⁵N] C2域。核磁共振样品中的蛋白质浓度在80到100之间μM.Ca公司²⁺储备溶液由1.0M标准氯化钙溶液制备而成（瑞士圣加仑Fluka Analytical）。对于每个配体浓度，¹⁵N个-¹在拉莫尔运行的瓦里安INOVA光谱仪上，在25°C下收集H异核单量子相关（HSQC）光谱¹500或600 MHz的H频率。对于化学位移微扰（CSP）和结合曲线分析，任何给定C2态对之间的残余特定化学位移变化都可以使用以下公式计算

式中Δδ_H（H）和Δδ_N个在¹H和¹⁵N个化学位移。通过绘制Δ与总配体浓度的关系来构建结合曲线。离解常数K_d日，对于pHM15与C2的结合是通过用单位点方程拟合结合曲线来确定的，

其中Δ_最大值，P₀、和L₀分别是完全饱和、总蛋白浓度和总配体浓度下的化学位移变化。表观离解常数K_{d、 应用程序}，对于Ca²⁺用修正的希尔方程拟合结合曲线，得到C2的结合(42)解释了钙的适度协同作用²⁺结合：

其中n_应用程序是反映明显合作性的希尔系数(43)钙的²⁺结合。有关结合数据分析的更多详细信息，包括残基选择标准和所有单独的结合曲线，请参见支持性材料，第3-5节。

结构验证、共振分配和结构约束的核磁共振实验

我们使用了镧系元素（Ln³⁺)-诱导伪接触位移（PCS）值以评估pHM复合C2的结构。肽pHM对应于疏水基序Ac-DQSDFEGFpSY-NH的高可溶性10氨基酸版本₂.[U的络合物-¹⁵N中，¹³C] 带Ln的C2³⁺通过结合等摩尔量的C2和LnCl制备（Ln=La、Tb和Tm）_三（Sigma Aldrich）溶于HPLC颗粒水中。在含有pHM的样品中，pHM浓度为600μM和C2-Ln的浓度³⁺复合物范围从40到60μM。¹⁵N个-¹H HSQC光谱在25°C下通过Avance III光谱仪（Bruker Biospin，Billerica，MA）采集¹H拉莫尔频率为500和600 MHz。PCS值通过减去特定残差¹H和¹⁵镧的N C2化学位移³⁺-含有Tm的反磁性配合物³⁺-和Tb^3个+-含有顺磁性复合物。反磁性C2-La的共振分配^3个+光谱是通过与之前指定的单个Pb光谱进行比较来完成的²⁺-绑定C2(39). 顺磁性C2光谱的共振分配是在Numbat中重复完成的(44)，使用Pb²⁺-C2的复合结构（蛋白质数据库（PDB）：3TWY）。

制备了两个核磁共振样品，其中C2或HM肽摩尔过量，用于C2的结构表征⋅钙²⁺⋅pHM复合物。样品1含有0.89 mM[U-¹³C、，¹⁵N] C2，2.23 mM氯化钙₂和2 mM pHM。样品2含有1.47 mM[U-¹³C、，¹⁵N] C2，3.75 mM氯化钙₂和0.6 mM pHM。C2准备后的最终缓冲条件⋅钙²⁺⋅pHM复合物在pH 6.0、67 mM KCl、8%（v/v）D下为6.7 mM MES₂O、 和0.02%（w/v）NaN_三。所有核磁共振数据都是在23°C下使用Avance III核磁共振仪器（Bruker Biospin）在¹H拉莫尔频率为500、600和800 MHz，后两个配备了低温冷却探头。对于样品1，主链的共振¹H、，¹³C、 和¹⁵使用二维（2D）对pHM络合物C2的N个原子进行赋值¹⁵N个-¹H HSQC，三维（3D）HNCO(45)，3D HN（CA）CO(46)和3D HNCACB(45)实验。侧链共振¹³C和¹使用2D分配H原子[¹³C类-¹H] HSQC、3D CC（CO）NH(47)，3D H（CCO）NH(48)、3D HCCH全相关光谱（TOCSY）(49)、三维HCCH相关光谱（COSY）(50)、和3D¹⁵N-TOCSY-HSQC公司(51)实验。芳香族的共振¹H原子被赋予2D aro-[¹³C-¹H] HSQC和3D aro-HCCH-TOCSY实验。

计算C2结构的NOE约束从3D中获得¹³C编辑的核过热效应光谱学（NOESY）-HSQC和¹⁵N编辑NOESY-HSQC实验(51,52,53)在样品1上进行。分子间C2-pHM NOE约束来自2D[F2]¹⁵N中，¹³C滤波NOESY，3D[F1]¹⁵N中，¹³C滤波NOESY-¹⁵N-HSQC和3D[F1]¹⁵N中，¹³C滤波NOESY-¹³C-HSQC公司(54)光谱。使用2D[F1]验证了这些交叉峰的分子间起源¹⁵N中，¹³C滤波NOESY和2D[F1，F2]¹⁵N中，¹³C滤波NOESY实验(55). 这个¹样品2中C2-结合pHM的H原子被赋予2D[F1，F2]¹⁵N中，¹³C过滤TOCSY和2D[F1，F2]¹⁵N中，¹³C滤波NOESY谱；后者用于计算pHM结构的NOE约束。所有NOESY实验的混合时间为120 ms。使用NMRPipe处理所有核磁共振数据(56). 使用Sparky进行分析和全原子赋值(57).

钙之间的协同作用²⁺和HM

钙²⁺绑定到C2域是PKC激活过程的第一步。我们使用溶液核磁共振测定钙的影响²⁺HM与C2的相互作用。含有[U的样品中pHM15的浓度-¹⁵N] 载脂蛋白C2或C2-Ca_n个变化范围为0至1.5 mM。这个¹⁵N个-¹在每个pHM15浓度下收集H HSQC光谱，并覆盖以识别由于与肽的相互作用而经历CSP的C2残基。对于两种C2状态，大量C2残基的N-H化学位移都发生了变化(图2,一和b条; 看见图S1对于全光谱）。随着pHM15浓度的增加，大多数C2交叉峰沿着平滑的轨迹移动，这表明无论金属连接状态如何，结合过程在核磁共振化学位移时间尺度上都很快。

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图2

HM与apo和Ca相互作用²⁺-绑定C2。(一和b条)的扩展¹⁵N个-¹[U的H HSQC光谱-¹⁵N] 载脂蛋白C2(一)和C2-Ca_n个(b条)，显示了增加pHM15浓度的效果，[pHM15]。根据[pHM15]对光谱进行叠加和彩色编码。化学位移因结合而改变的C2的N-H基团被标记。(c（c）)CSPs，Δ，由于C2-Ca的所有光谱分解残基的pHM15结合_n个(顶部)和载脂蛋白C2(底部). 使用C2-Ca的零和1.5 mM[pHM15]光谱计算残留物特定Δ值_n个(顶部)和载脂蛋白C2(底部). 星号表示脯氨酸或增宽/未光谱分解的残基。插图显示了四个Trp残基的吲哚侧链胺基团的CSP。(d日)C2结构域与三钙络合的晶体结构²⁺离子，PDB：3GPE公司.Ca的CSP²⁺-pHM结合导致的复杂C2域被彩色编码并映射到结构上。钙²⁺离子显示为绿色球体。要查看此图的颜色，请联机。

我们应用CSP分析来确定受与HM相互作用影响的C2区域。在不含肽的一对C2状态和1.5 mM pHM15之间计算CSP值Δ，并根据C2的氨基酸序列绘制(图2 c（c）). 虽然载脂蛋白C2的化学位移幅度发生了变化(图2 c（c）,底部)小于C2-Ca_n个(图2 c（c）,顶部)，整体格局非常相似。我们得出结论，Ca²⁺结合并没有显著改变C2与HM的相互作用模式。

钙的晶体结构²⁺-绑定C2(69)为解释观察到的CSP提供了结构上下文。我们选择这个特殊的结构来显示弱第三钙的位置²⁺位点，其存在可通过NMR在高Ca下检测²⁺浓度(图S2) (68). C2结构域有两个主要功能区²⁺-和膜结合环（CMBLs）和富含赖氨酸的簇（LRC）。CMBL1和CMBL3为Ca提供含氧配体²⁺连接蛋白质和负电荷阴离子磷脂基团的离子。LRC是C2结构域与信号脂质PtdIns（4,5）P的相互作用位点₂(69). CSP数据表明，受与HM交互影响显著的区域包括C2的主要功能元素，即CMBL1、CMBL3和LRC。C端螺旋H3也受到影响，但程度较小。之前在PtdIns（4,5）P的核磁共振研究中观察到类似的CSP模式₂-C2交互(70)，表明C2域与HM的相互作用面包括LRC。

确定Ca如何²⁺并且pHM15相互影响对C2结构域的亲和力，我们共进行了四次NMR检测结合实验，其中我们将1）pHM15添加到Ca²⁺-络合C2；2） pHM15至载脂蛋白C2；3） 钙²⁺pHM15-络合C2；和4）钙²⁺至apo C2。为了确定配体亲和力，我们通过绘制残基特异性化学位移变化与总配体浓度的关系来构建结合曲线。结合实验1的一个特殊考虑是确保我们的分析仅反映pHM15的结合，并且不受C2结构域吸收额外Ca的影响²⁺通过其通常较弱的第三个站点。基于我们之前的发现，即通过与带负电荷的PtdIns（4,5）P的相互作用中和电正LRC区域，后一种情况是可行的₂导致C2对二价金属离子的亲和力增加(70). 有关选择标准、所有约束曲线以及数据分析的其他相关详细信息，请参见支持性材料，第3-5节。

我们的实验的主要结果用典型的结合曲线进行了说明(图3)我们根据以下标准选择：1）给定残基的结合曲线对两种状态都可用；残基属于C2的主要功能元件。我们的第一个发现是Ca²⁺基于K，增加C2对HM的亲和力～2.0倍_d日116±5和200±5的值μM代表Ca²⁺-分别为绑定和载脂蛋白C2(图3 一;图S3和S4系列). 相反的实验，我们测量了C2结构域对钙的亲和力²⁺在没有和存在pHM15的情况下(图3 b条;图S6)揭示了相同的模式：pHM15的存在增加了C2对Ca的亲和力²⁺～4倍。中位数K_{d、 应用程序}数值从393降至108μM、 而表观希尔系数从1.3增加到1.5。我们得出结论，钙之间存在明显的协同作用²⁺以及pHM15与C2的相互作用，表现为它们与C2结构域的亲合力相互增强。

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图3

钙的协同作用²⁺和HM(一)pHM15与载脂蛋白C2结合的代表性曲线(开放的圆圈)和C2-Ca_n个(实心圆). (b条)Ca的代表曲线²⁺绑定到apo C2(开放三角形)和C2●pHM15(实心三角形). 在这两种情况下，一种配体的亲和力在另一种配子的存在下增强。要查看此图的颜色，请联机。

我们的体外亲和力测量与全长PKC的行为有什么关系？在全长酶中，HM和C2位于同一多肽链上。即使在没有钙的情况下，这也有利于形成分子内C2-pHM相互作用²⁺我们的结合数据表明，分子内C2-pHM相互作用将使Ca增加至少四倍²⁺与孤立C2结构域相比，非活性PKC的亲和力。加利福尼亚州²⁺在酸性磷脂存在的情况下，PKC的敏感性进一步增加，最终使膜结合和随后的活化在低微摩尔钙浓度下成为可能²⁺(71,72).

C2（Ca）的结构表征²⁺)₂●pHM复合物

为了剖析C2与HM相互作用的结构基础，我们制备了一种由Ca组成的复合物²⁺-结合C2和10残基pHM肽。pHM与pHM15结合到相同的C2位点(图S7)，但对钙的亲和力稍高²⁺-络合C2（K_d日为94±3μM） 和比pHM15更高的溶解度，这对于制备用于结构研究的样品至关重要。作为第一步，我们使用核磁共振波谱确定了配合物中C2结构域的结构。实验限制包括NOE、二面角、氢键和金属离子氧配位对两种钙的限制²⁺离子(表S3). C2（Ca）溶液核磁共振系综的叠加²⁺)₂在apo（PDB：第三代RDJ(39))和钙²⁺-绑定C2（PDB:1DSY公司(73))两者的主根均方偏差（RMSD）值均为1.1±0.1Ω(图4 一).

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图4

(一)C2（Ca）的主干叠加²⁺)₂核磁共振系综（PDB:第二届NCE,灰色)具有apo（PDB：第三代RDJ,蓝色)和钙²⁺-复合C2（PDB:1DSY公司,橙色). (b条)的扩展¹⁵N个-¹H HSQC光谱显示Ln³⁺-C2-Ln的诱导假接触位移³⁺在pHM的15倍摩尔过量的情况下。(c（c）)PCS值的对应相关图。插图显示了LRC残留物的PCS相关数据；LRC是pHM与C2的相互作用位点。实线为x=y，虚线为x=y±0.15；±0.15是PCS测量的典型不确定度。要查看此图的颜色，请联机。

为了确定无pHM和络合C2在溶液中的结构是否相似，我们比较了¹H和¹⁵顺磁性镧系元素诱导的N个伪控制位移（PCS）。镧系元素诱导的PCS是蛋白质结构的敏感报告子，因为它们在磁化率张量Δ的坐标系中依赖于NMR活性核的极坐标χC2域绑定一个Ln³⁺具有高亲和力的离子。结合位点与高亲和力Pb一致²⁺我们之前描述的结合位点(39).

我们选择了两种顺磁性镧系金属离子，Tb³⁺和Tm³⁺，具有相对较大的Δχ，但轴向和菱形Δ的相反符号χ组件(图4 b条). PCS值被计算为顺磁性和反磁性La中化学位移之间的差值³⁺C2复合物。为了确保大多数C2是pHM结合形式，我们使用了pHM超过C2的15倍摩尔过量的样品。对于两个Tb³⁺和Tm³⁺，我们观察到C2残基的主干PCS值之间具有良好的相关性，包括在没有pHM和存在pHM的情况下属于LRC的那些残基(图4 c（c）). 这些结果表明，C2主链构象在无pHM和结合形式中具有相似性。

测定C2（Ca）中pHM的构象²⁺)₂●pHM复合物，一个单独的NMR样品是用C2摩尔过量制备的，以确保≥90%的pHM是以C2复合形式存在的。我们从[¹⁵N中，¹³C] -过滤2D¹H（H）-¹配合物的H NOESY光谱。自由pHM和C2-bound pHM的NOESY光谱的比较显示了与C2相互作用的明显特征，例如旋转相关时间的增加和复杂形成引起的化学位移变化(图S8). pHM结构计算中总共使用了99个明确的NOE。其中绝大多数是分子内和顺序的，而只有两个是中等范围的(表S2). pHM的核磁共振系综显示肽的扩展构象，主链RMSD为2.4±0.6μ(图S9). 这种构象在蛋白质-肽复合物中相当常见：对103个非冗余复合物的结构分析表明，64%的肽以延伸构象或线圈构象结合，而只有17.5%和18.5%的肽以延长构象或卷曲构象结合α-和β-链构象(74).

C2●（钙²⁺)₂·pHM复合物通过静电和芳香相互作用稳定

获得C2（Ca）的结构约束²⁺)₂对于pHM复合物，我们进行了同位素过滤/编辑NOESY实验，在C2和pHM之间产生了29个分子间NOE。由于复合物的低亲和力，预计分子间NOE的数量会如此之少。从头计算结构产生了一个复合体，其中pHM与C2的LRC相结合，但具有一个低应变的N末端。这是因为所有分子间NOE都来自pHM的富含芳烃的C末端部分(表S4). 因此，我们选择使用HADDOCK 2.2/CNS 1.3，其中使用（除其他术语外）分子间静电能术语来对结构进行评分。分子间NOE被用作明确的约束，而CSP被用作¹⁵N和¹H（H）_N个由于pHM结合，C2被用作模糊约束(表S4). 钙的核磁共振谱系²⁺-结合C2和pHM，均在C2（Ca²⁺)₂●pHM复合物，然后用于生成其结构模型。

C2（Ca）的400个结构²⁺)₂●在最终精炼步骤中产生的pHM复合体始终具有pHM与承载LRC区域的C2凹面相互作用。人口最多的簇1包含41.5%的结构，并且在六个簇中平均分子间相互作用能最低。C2（Ca）的20个得分最高的结构²⁺)₂●pHM复合体也属于簇1，并形成一个紧密的系综，C2结构域的主干RMSD为0.41±0.05º，pHM为0.8±0.2º(表S5).

C2（Ca）的顶级结构²⁺)₂●pHM说明HM和C2域之间的交互模式(图5 一). pHM与C2域的凹面结合，并与两个主要功能元件LRC区和Ca接触²⁺-绑定环路CMBL3。pHM的构象被延伸，N末端指向链之间的环β3和βLRC的4个和指向CMBL3的C终端。C2-pHM界面通过静电和芳香相互作用稳定(表S7). 静电相互作用涉及pHM残基负电荷侧链和C2结构域正电荷侧链之间的盐桥。例如，Lys197、Lys209和Lys211与Asp652的侧链形成盐桥，Lys213与Ser657的磷酰氧形成盐桥(图5 d日). HM的两个苯丙氨酸残基653和656与C2的芳香残基Tyr195、Trp245和Trp247的环堆积相互作用(图5 c（c）). 阳离子-πLys197、Arg252和Phe653芳香环之间的相互作用进一步稳定了界面。中列出的所有残留物表S7，除Asn206外，在传统的PKCs中是保守的。

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图5

C2-pHM界面通过静电和芳香相互作用稳定。(一和b条)C2·（Ca）的20个顶级结构²⁺)₂●pHM复合物，pHM和LRC/CMBL3分别以红色和紫色突出显示。钙²⁺离子表示为绿色球体。(c（c）和d日)配合物的界面由芳香族化合物稳定(c（c）)和静电(d日)互动。C2的带电/极性侧链和芳香侧链分别以绿色和深灰色显示；所有pHM侧链均为金色。相互作用残基标记为红色（pHM）和黑色（C2）。要查看此图的颜色，请联机。

C2-V5界面突变影响PKCα构象

为了评估C2-V5界面的扰动如何影响酶的构象偏好，我们使用了分子内稳态FRET测量。在缺乏全长PKC结构的情况下，荧光团在自抑制形式中的相对位置尚不清楚，FRET效率变化的幅度不能简单地解释为构象失稳的程度。因此，我们使用体外FRET结果作为构象扰动的定性指示。

以C2（Ca）的结构信息为指导²⁺)₂●pHM复合物，我们设计了靶向静电和芳香相互作用的突变，并将其引入mCer-PKCα-mCit-FLAG PKCα（请参见图5和6 一). 在没有PKC活化剂的情况下进行稳态FRET实验。PKC的代表性荧光光谱α变体说明FRET反应的幅度(图6 b条). “no-FRET”控制频谱(黑色痕迹)收集野生型蛋白质，该野生型蛋白质经过部分蛋白水解，mCit和mCer保持完整。在完整野生型PKC的光谱中α(蓝色痕迹)，由于蛋白质末端之间的FRET，525nm处mCit发射峰的强度增加。PKC的荧光光谱α变体说明由于界面处静电和芳香相互作用的扰动，FRET效率降低。

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图6

C2-V5界面突变影响PKC构象α. (一)PKC的身份α变体。(b条)野生型PKC的荧光发射光谱α和选定的变体。原理图描述了PKCα用于体外荧光测量的结构。(c（c）)从至少三次独立测量中获得的所有变量的FRET比值（平均值±SE）。分组与中相同(一). 要查看此图的颜色，请联机。

FRET数据以受体/供体强度比表示，根据靶向相互作用的类型/细节分为三组(图6 c（c）). 在携带V5结构域的残基Asp652突变的变体中观察到最低的FRET比率。根据我们的结构模型(图5)，Asp652参与和LRC的赖氨酸残基的静电相互作用。KK变异体中Lys209和Lys211突变为谷氨酸盐也导致FRET效率降低。DKK变体中的同时电荷反转不会产生“野生型”FRET响应，这表明野生型构象不能通过同时电荷反转简单地恢复。S657A/K213A相互作用以及芳香族接触的中断产生的FRET比率在0.86–0.94范围内。总的来说，所有PKCα与野生型蛋白相比，本研究中产生的变体FRET效率更低，表明C2-V5界面受到干扰。

这项工作得到韦尔奇基金会赠款A-1784（T.I.I.）的支持。国家卫生研究院拨款GM108998（T.I.I.）和国家科学基金会职业奖CHE-1151435（T.I.I）提供了额外支持。Y.Y.是美国心脏协会的博士前研究员（奖项编号：14PRE20380475）。