结果
激活后，PKA-C从神经元中的PKA-R/AKAP复合物中分离
进行了两个实验，以观察激活后PKA-C是否可以从PKA-R/AKAP复合物中释放出来就地在神经元树突中。
首先，我们使用双光子荧光寿命成像显微镜（2pFLIM）(Yasuda等人，2006年)在大鼠器官型培养海马脑片中定量C末端EGFP标记的PKA-Cα亚型（PKA-C-EGFP）和C末端sREACh标记的PKA-RIIβ（PKA-RIIβ-sREACh）之间的Förster共振能量转移（FRET）(). sREACh是低辐射YFP(Murakoshi等人，2008年). 2pFLIM测量荧光寿命，即荧光团激发和施主荧光团光子发射之间的平均时间，当FRET发生时，该时间缩短。2pFLIM在量化FRET方面的优势之一是可以确定PKA-C-EGFP和PKA-R-sREACh之间的结合比。如果PKA-C在活化后离开PKA-R，其结合率（如2pFLIM定量）将降低().
活化后PKA-C与PKA-R分离的一部分（A） 基于FRET/FLIM的PKA解离测量示意图。R： PKA-RIIβ，C:PKA-C，G:GFP和sR:sREACh。（B，C）代表性2pFLIM图像和在去甲肾上腺素（NE）或福斯科林和IBMX（F+I）存在下PKA解离的定量。n=8个单元。（D，E）培养海马脑片CA1神经元树突中PKA-C-EGFP和PKA-RIIβ-EGFP定位的代表性图像和定量。红细胞溶质标记mCherry共同表达以揭示神经元形态。PKA-C的n=69/11（棘/细胞），PKA-RIIβ的n=25/6。另请参见图S1和S2.
休息时，PKA-C-EGFP的结合率为27±2%。这种低结合率可能是由于大量内源性PKA-R（在许多细胞类型中约为0.2–0.7μM）(弗洛克哈特和科尔宾，1982年;弗朗西斯和科尔宾，1994年)sREACh的不完全折叠(Murakoshi等人，2008年). 应用20μM去甲肾上腺素，这是神经元内源性释放的中等范围(Courtney和Ford，2014年)，使神经元树突的结合率降低12±3%(，p<0.01（峰值，参考基线），表明PKA-c-EGFP的一小部分但很重要的部分与PKA-RIIβ-sREACh分离。使用forskolin和IBMX进行更强的刺激后，结合率比基线降低约70%(). HEK 293细胞共免疫沉淀（Co-IP）实验表明，经forskolin和IBMX刺激后，55±7%的PKA-C-mCherry仍与PKA-RIIβ和AKAP5-EGFP结合(图S1)这表明HEK细胞中PKA的激活强度低于神经元。通过向IP反应中添加cAMP类似物Sp-8-pCPT-cAMP（5μM），几乎完全消除了剩余的结合（保留6±3%的结合）。因此，毛喉素和IBMX不能使细胞内cAMP水平升高到足以引起完全解离的程度。总的来说，这些结果表明，在生理cAMP升高时，PKA-C的一部分从PKA-R中释放出来。
其次，我们在参考红细胞溶质标记物（mCherry）的单独实验中，监测了与未标记的PKA-RIIβ共同表达的PKA-C-EGFP的亚细胞动力学，或仅用PKA-RII-β-EGFP。表达的PKA-C和PKA-RIIβ的分布反映了内源性PKA蛋白的分布(Parisiadou等人，2014年;Zhong等人，2009年). PKA-C-EGFP和PKA-RIIβ-EGFP在基础条件下表现出相似的亚细胞分布：树突轴中PKA亚基的浓度高于相邻棘(和S2系列). 该分布通过脊柱富集指数（SEI）进行量化() (Zhong等人，2009年)以下为：
阳性SEI意味着脊椎中蛋白质富集；而SEI阴性则表示被排除在脊柱之外。用去甲肾上腺素刺激后，PKA-C-EGFP转位到树突棘（静止时SEI=−0.84±0.07，刺激后6分钟时SEI=-0.31±0.06，p<0.001）(和S2系列). Forskolin和IBMX诱导了进一步的易位（SEI=0.71±0.03，p<0.001，对比基线）。相反，在相同条件下，PKA-RIIβ-EGFP的分布没有改变（休息时SEI=−0.92±0.07，去甲肾上腺素为−0.97±0.07、福斯科林和IBMX为−1.09±0.07；刺激后p<0.001 c.f.PKA-c-EGFP）(). PKA-C转位到脊椎的部分必须与PKA-R/AKAP复合物分离。
PKA-C的迁移率明显低于细胞溶质蛋白
接下来我们检测了释放的PKA-C的活动性。用光活化GFP（paGFP）转染CA1神经元(Patterson和Lippincott-Schwartz，2002年)标记的PKA-C（PKA-C-paGFP）、PKA-RIIβ和mCherry。我们使用焦点双光子光激活将paGFP不可逆地转换为明亮状态，并监测随着时间的推移产生的荧光衰减，作为PKA-C迁移率的分析() (Bloodgood和Sabatini，2005年;格雷等人，2006年). 为了优先检查释放的PKA-C，我们将重点放在脊柱上，以利用其低基础PKA-C浓度(). 脊椎处荧光衰减的时间常数（即脊椎滞留时间）与蛋白质的扩散系数成线性反比(Bloodgood和Sabatini，2005年). 在去甲肾上腺素存在下，PKA-C-paGFP的脊髓滞留时间比胞浆paGFP长约8倍（PKA-C-paGFP的τ=2.11±0.06 s，paGFP为0.26±0.01 s；p<0.001；)表明PKA-C的迁移率远低于自由扩散的细胞溶质蛋白。用forskolin和IBMX进一步增加细胞内cAMP浓度并没有使PKA-C-paGFP扩散更快（τ=2.34±0.08 s），这表明低迁移率不是由于在低cAMP含量下与PKA-R残留结合所致。
活化的PKA-C通过N-末端肉豆蔻酰化比胞质蛋白移动得慢（A） 野生型和非肉豆蔻酰化（nm）PKA-C融合到paGFP的双光子介导光激活实验的代表性图像系列，如图所示，位于CA1神经元的树突棘中。未标记的PKA-RIIβ和mCherry共同表达。浴中应用20μM去甲肾上腺素激活PKA。paGFP在时间零点几乎瞬间在脊柱头部（白色仪表板）被光激活。（B） 在去甲肾上腺素存在下表达所示结构的脊椎的代表性荧光衰减曲线。（C） 所示构造的脊椎停留时间的集合数据。如有说明，添加去甲肾上腺素或福斯科林和IBMX。颜色对应于面板B中的颜色。paGFP的n=193/10（棘/细胞）；PKA-C加去甲肾上腺素148/9；157/8适用于PKA-C，带有forskolin和IBMX；HRa为208/11；KRas为99/5；标记126/7；96/11针对nmPKA-C和去甲肾上腺素。（D） PKA-C扩散的决定因素分析。在需要PKA刺激的地方添加Forskolin和IBMX。nmPKA-C的n=111/5（棘/细胞）；altPKA-C为100/7；PKA-C-S11A（S11A）为161/8；针对PKA-C-S11D的136/7（S11D）；PKA-Cn为40/4；nmPKA-Cn为50/5。另请参阅图S3.
PKA-C的低迁移率不能用PKA-C-paGFP（67 kD）比paGFP更大的尺寸来解释。仅基于大小（球形蛋白质的扩散系数与分子量的立方根成比例增加(Papadopoulos等人，2000年))PKA-C-paGFP的扩散速度预计比paGFP慢约35%，对应于约0.4 s的脊椎滞留时间，远小于观察到的值。事实上，当我们使用光漂白后荧光恢复（FRAP）来测量总分子量为100kD的四聚体蛋白DsRed Express的迁移率时，脊椎滞留时间为0.45±0.03s，仍然比PKA-C快5倍。
N-末端肉豆蔻酰化导致PKA-C的低迁移率
PKA-C-paGFP的脊柱停留时间与HRas、KRas和蛋白激酶C（PKC）底物MARCKS蛋白相当()（另请参见(Harvey等人，2008年))通过脂质修饰与膜外周结合。在大脑的大多数部位，大多数PKA-C亚型在其N端进行共翻译肉豆蔻酰化(Gangal等人，1999年;Guthrie等人，1997年;Johnson等人，2001年;Shoji等人，1983年)，尽管这种脂质修饰通常被认为折叠到PKA-C的疏水口袋中以增强其稳定性(Bastidas等人，2013年;Clegg等人，1989年;Yonemoto等人，1993年;Zheng等人，1993年).
我们询问肉豆蔻酰化是否是PKA-C流动性低的原因。肉豆蔻蔻酰基化位点通过将第二位甘氨酸转变为丙氨酸（G2A）而发生突变。这种突变并不影响PKA-C和PKA-R/AKAP复合物之间的相互作用(图S3)或酶的催化效率（后者见(Clegg等人，1989年)). 由此产生的突变体nmPKA-C-paGFP的移动速度明显快于野生型（NE刺激τ=0.73±0.03 s，; 对于forskolin和IBMX刺激，τ=0.83±0.03，; 两者的p<0.001 c.f.野生型），但仍慢于paGFP。一种睾丸特异的天然存在的PKA-C选择性剪接亚型，缺乏肉豆蔻酰化位点（称为altPKA-C）(Desseyn等人，2000年;San Agustin等人，1998年)，也比肉豆蔻酰化神经元亚型移动更快（τ=0.85±0.04s，p<0.001）(). 此外，在paGFP中添加PKA-C肉豆蔻酰化序列（N末端47个残基）似乎足以以肉豆蔻蔻酰依赖的方式将paGFP的扩散速度减慢7倍以上（结构名为PKA-Cn-paGFP，τ=1.96±0.14 s，p<0.001 C.f.paGFP）（nmPKA-Cn-paGFP的τ=0.36±0.02s，p<0.001 C.f.PKA-Cn-paGFP） (). 因此，低迁移率是PKA-C固有的，不太可能是由于释放的PKA-C与PKA-R的残余相互作用。对这些结果的最简单解释是肉豆蔻酰化使PKA-C与膜结合。
PKA-C活化后与膜结合
为了确定释放的PKA-C是否确实与膜相关，我们对CA1神经元激活前后PKA-C的运动进行了成像。我们表达了PKA-C-EGFP和PKA-RIIβ以及细胞溶质标记物（DsRed Express或mCherry），并测量了PKA-C-EGFP沿粗（>=1.5μm）初级顶端树突的横切线的强度分布，并将其与细胞溶质标志物的强度分布进行了比较(). PKA-C-EGFP的分布与静止时的细胞溶质标志物相似。然而，在PKA活性刺激后，观察到外周PKA-C-EGFP荧光增强，树突中心荧光减弱()表明PKA-C向质膜移位。为了量化这种现象，我们计算了膜富集指数（MEI）：
其中F是荧光强度。在接近树突边缘的位置测量外围荧光强度(，下部面板），根据红色荧光为峰值荧光30%的位置确定(图S4). MEI值大于1表示膜富集，而小于1表示膜排斥。对于静止状态下的野生型PKA-C，MEI略低于1（MEI=0.89±0.02，p<0.01，C.f.1），与PKA-RIIβ的MEI=0.88±0.02（p=0.67，C.f.PKA-C）相似()，表明蛋白质的胞质定位。用去甲肾上腺素刺激PKA导致MEI增加（0.95±0.03，p=0.01 c.f.基线）。使用forskolin和IBMX，MEI进一步增加到远高于1（1.41±0.03，p<0.001）。刺激后PKA-RIIβ的分布没有显著变化(). 因此，只有释放的PKA-C转位与膜结合。
N-末端肉豆蔻酰化靶向神经元质膜PKA-C（A） 休息时和经forskolin和IBMX刺激后，CA1神经元初级顶端树突中野生型PKA-C分布的顶部代表性单z平面图像。底部，PKA-C（绿色）和胞浆标记物（红色）的荧光线轮廓沿着顶部图像中的白色虚线。黑色虚线表示最大红色荧光的30%。灰色条表示测量的位置。（B） 刺激前后指示结构的平均MEI。n=PKA-Cn的8个细胞，PKA-C的11个细胞，PKA-RIIβ的6个细胞，nmPKA-C、altPKA-C和PKA-RIIα-Δ2-5共表达的5个细胞。使用Wilcoxon符号秩检验检验统计显著性，因为数据在各组内相互关联。（C，D）海马锥体神经元的代表性2pFLIM图像（C）和基线下EGFP寿命（D），在基线和刺激条件下表达FRET受体与受体的组合。另请参见图S4、S5和S6.
刺激后PKA-C的MEI值似乎适中。这可能是因为只有一小部分PKA-C被释放，而剩余的PKA-C仍在胞浆中(和S1（第一阶段）). 释放的PKA-C也可能与细胞膜有亲和力。为了证实释放的PKA-C与膜相关，我们共同表达了PKA-C-EGFP、PKA-RIIβ和mCherry标记的MARCKS，这是已知的PKC膜底物(Sundaram等人，2004年)，在CA1神经元中（参见图S5A用于实验设计）。PKA-C-EGFP的膜结合将导致EGFP和mCherry之间的FRET增加，并相应地降低EGFP的寿命。经forskolin和IBMX刺激后EGFP的荧光寿命降低(; 另请参见图S5B和S5C以及它们关于图中所示集群噪声的图例). 当EGFP单独表达或用细胞溶质mCherry代替MARCKS-mCherry时，未观察到寿命下降。该实验进一步表明，活化后至少有一部分PKA-C与膜结合。
PKA-C与膜的结合需要肉豆蔻酰化吗？当G2A突变消除肉豆蔻酰化修饰时，PKA-C向质膜的易位大大减少，但并没有完全消除（激活前，MEI=0.96±0.05，p=0.02，C.f.野生型；毛喉素/IBMX激活后，1.10±0.02，p<0.001，C.f.野生型，p=0.02，C.f.1）或通过自然发生的替代剪接变体（激活前，MEI=0.93±0.03，p=0.39，c.f.野生型；激活后，1.10±0.02，p<0.001，c.f.野生型，p<0.01，c.f.1）(). 总之，这些结果表明，在基础条件下，PKA-C分布在休眠树突的胞浆中，并与PKA-R/AKAP复合物结合。cAMP升高并从PKA-R中释放后，释放的PKA-C转位到膜上，大部分需要N-末端肉豆蔻酰化。
PKA-C的膜结合不需要AKAP锚固
我们询问PKA-R与AKAP的锚定是否影响PKA-C与膜的亲和力。当PKA-C与PKA-RIIβ-Δ2–5共同表达时，其不再结合AKAP(图S3) (Hausken等人，1994年;Zhong等人，2009年)，活化的PKA-C的MEI达到与使用野生型PKA-RIIβ时相同的水平（毛喉素/IBMX活化后PKA-RIIβ-Δ2-5的MEI=1.38±0.05，p=0.6，C.f.野生型PKA-RIIβ；)表明PKA-C的膜亲和力不需要AKAP结合。进一步的预测是，当PKA-C与不再与AKAP结合的PKA-RIIβ-Δ2–5共同表达时，其在激活前的流动性应该很高，因为PKA全酶不再锚定。活化后，PKA-C的迁移率会随着其与膜的结合而下降。事实确实如此(). 当PKA-RIIβ-Δ2–5共同表达时，PKA-C-paGFP的基线棘突滞留时间为1.57±0.07 s，这可能是由于加利福尼亚州0.8倍大（带有paGFP标签的全酶约220kD）和PKA-R的非小叶形状(Smith等人，2013年). 然而，与野生型PKA-RIIβ共同表达的活化PKA-C相比，该结构的移动速度更快（p<0.001）。经forskolin和IBMX刺激后，脊髓滞留时间增加至2.59±0.13 s（p<0.001，激活前c.f.）(). 作为对照，PKA-RIIβ-Δ2-5-paGFP在刺激前后的脊髓滞留时间没有变化（刺激前1.60±0.09 s；刺激后1.55±0.10 s；p=0.68；). 以及N末端47残基足以实现低PKA-C迁移率的证据()并在膜上富集()，膜亲和力可能是PKA-C的固有特性，不需要AKAP锚定。然而，应该注意的是，AKAP仍可能在与膜PKA-C相关联中发挥作用。
PKA-C的低迁移率不需要AKAP结合（A，B）forskolin/IBMX刺激前后所示构造组合的平均荧光衰减曲线（A）和棘滞留时间（B）。刺激后PKA-C-paGFP/RIIβ的数据与n=PKA-C-paGFP/RIIβ-Δ2–5的（脊髓/细胞）57/8；RIIβ-Δ2–5-paGFP为51/9。
内源性PKA活性在膜上富集
上述实验涉及PKA亚单位的过度表达。内源性PKA-C也与膜相关吗？通过MEI值与相应的PKA-C-EGFP表达水平之间的相关性推断出非过度表达状态下的MEI(图S6). 结果值（激活前MEI=0.92，激活forskolin和IBMX后MEI=1.42）表明内源性PKA-C也经历刺激依赖性的细胞膜移位。此外，该模型预测膜上内源性PKA激酶活性应该更高。为了验证这一预测，我们使用2pFLIM对A激酶活性报告子（AKAR）进行成像(Zhang等人，2001年). 我们优化了AKAR（AKAR4）的最新版本(Depry等人，2011年)通过将供体和受体荧光团对改为单体EGFP和sREACh来实现2pFLIM。这种新传感器被命名为AKAR5。另外还产生了两个变体：1）通过用KRas的C末端15个氨基酸残基标记AKAR5，形成膜相关型（命名为m-AKAR5）(Hancock等人，1989年)，和2）通过将AKAR5链接到核输出序列（NES），获得细胞溶质版本（命名为cyt-AKAR5）(福田等人，1996年). 独立地，最近报道了AKAR的类似改进(Chen等人，2014年).
我们比较了相同条件下HEK 293细胞中cyt-AKAR5和m-AKAR5对PKA刺激的反应。为此，将m-AKAR5与核标记物mCherry-histone2b（红色）共转染。然后，将这些转染细胞与仅转染cyt-AKAR5的其他细胞共培养。因此，在同一视野内，具有红核的细胞表达m-AKAR5，而其他细胞表达cyt-AKAR5(). 休息时，m-AKAR5的EGFP寿命显著低于cyt-AKAR5(（由休息时2pFLIM图像中较暖的颜色表示），可能反映了基础cAMP浓度，导致膜上已富集的PKA活性水平较低。重要的是，0.1-μM去甲肾上腺素的轻度刺激强烈激活M-AKAR5，使其达到福斯科林和IBMX诱导的最大反应的88±6%(). 在相同条件下，cyt-AKAR5中度激活（41±7%，p<0.001）。cyt-AKAR5和m-AKAR5之间的差异并不是由于胞浆中磷酸酶活性较高，因为在应用广谱磷酸酶抑制剂冈田酸后(Bialojan和Takai，1988年;Reinhart等人，1991年)，只有m-AKAR5而cyt-AKAR5对较高水平的磷酸化有反应(). 因此，m-AKAR5更容易磷酸化，表明内源性PKA激酶活性在膜上富集。
膜相关AKAR5对内源性PKA活性刺激的敏感性高于胞浆AKAR5（A） HEK 293细胞单独表达cyt-AKAR5或与mCherry-histone2b共表达mAKAR5的代表性双光子荧光强度图像（左）和2pFLIM图像序列（右）。（B） m-AKAR5和cyt-AKAR5对0.1μm去甲肾上腺素的集体寿命变化，随后是forskolin和IBMX。n-AKAR5为13，cyt-AKAR5为9。（C） cyt-AKAR5和m-AKAR5对用100nM冈田酸（OA）处理，然后用毛喉素和IBMX处理的寿命响应。n＝20。（D） 神经元对0.3μm去甲肾上腺素的反应中AKAR5′和m-AKAR5’的寿命变化归一化为forskolin和IBMX诱导的最大反应。两种结构的n=5。
神经元的膜上是否也富含内源性PKA活性？AKAR5的一个变体（命名为AKAR5′，其中使用循环置换版本的sREACh来模拟AKAR4中使用的循环置换金星(Depry等人，2011年))其膜相关版本（m-AKAR5′）分别在培养切片的CA1神经元中表达。通过去甲肾上腺素（0.3μM）对PKA通路的轻度刺激导致M-AKAR5′几乎饱和反应，但仅适度激活细胞溶质AKAR5’（M-AKAR5'最大反应的85±5%，AKAR5'50±8%；p<0.01）(). 这一结果表明，内源性PKA激酶活性也在神经元膜上富集。
PKA以肉豆蔻酰化依赖的方式优先磷酸化存在于膜上的底物
如果PKA活性在膜上富集，膜上的底物将优先磷酸化，而不是胞浆中的相同底物。我们通过使用AMPA受体亚单位GluA1来测试这一预测，该亚单位可以通过PKA在丝氨酸845的C末端末端磷酸化(Colledge等人，2000年;Lee等人，2000年). EGFP标记的GluA1或其细胞溶质C尾（GluA1c）表达()通过将磷酸化S845特异性抗体的西区信号标准化为普通GluA1 C末端抗体的西段信号，对其磷酸化水平进行量化。在两个HEK 293细胞中()以及在皮层原代神经元培养中()在去甲肾上腺素或forskolin/IBMX刺激细胞时，EGFP-GluA1被强烈磷酸化。这种磷酸化被PKA拮抗剂H89阻断。然而，在相同条件下，EGFP-GluA1c的磷酸化几乎无法检测到。EGFP-GluA1c的磷酸化通过与无关的单跨膜蛋白CD4（构建物CD4-EGFP-GruA1c，). 因此，当底物位于膜上时，内源性PKA可以更有效地磷酸化该底物。
PKA以AKAP依赖和肉豆蔻酰化依赖的方式优先磷酸化膜结合底物（A） 基板结构的示意图。（B，C）HEK细胞中指示结构的S845磷酸化的代表性蛋白质印迹（B）和定量（C），这些结构经历了指示的刺激。n=5个EGFP-GluA1独立实验，4个EGFP/GluA1c独立实验，5个CD4-EGFP-GruA1c独立试验。（D，E）在原代大鼠皮层神经元培养物中进行的GluA1和GluA1c S845磷酸化的代表性蛋白质印迹和集体结果。（F，G）HEK细胞中指示结构的代表性蛋白质印迹和S845磷酸化的集体结果，HEK细胞经过指示的刺激，无论是否预先用St-Ht31孵育。n=5（去甲肾上腺素）和4（F+I）。（H，I）具有代表性的western blots和联合IP实验的集体结果，包括或不包括St-Ht31治疗。如图所示，PKA-C和AKAP5与野生型或突变型PKA-RIIβ共同表达。n=4。（J） 如图所示，表达PKA-RIIβ、EGFP-GluA1和EGFP-GluA1c的HEK293细胞以及野生型PKA-C或nmPKA-C经1μM NE或forskolin/IBMX处理后的代表性蛋白质印迹。（K） GluA1（顶部）和GluA1c（底部）相对磷酸化水平的汇总结果。n=6。（五十） 不同处理条件下野生型PKA-C和nmPKA-C的MPPI。
膜底物的优先磷酸化似乎也是PKA-C固有的，并且不依赖于AKAP。我们在HEK 293细胞中共同表达EGFP-GluA1和EGFP-GluA1c，并在存在膜透性肽St-Ht31（20μM）的情况下用去甲肾上腺素或forskolin/IBMX处理细胞，该肽破坏AKAP与PKA的结合(Carr等人，1992年). 这种处理并没有降低EGFP-GluA1的PKA磷酸化，也没有增加EGFP-GluA1c的磷酸化(). 在co-IP分析中，St-Ht31治疗似乎有效，因为它显著降低了PKA-C和PKA-RIIβ与EGFP-AKAP5的结合().
PKA对膜底物的优先磷酸化是否涉及肉豆蔻酰化？为了测试这种可能性，我们分别在同一细胞中表达PKA-C-EGFP或nmPKA-C-EGFP，以及PKA-RIIβ、EGFP-GluA1和EGFP-GulA1c，并使用膜磷酸化偏好指数比较膜和细胞液中的磷酸化水平：
较高的MPPI反映了与胞浆中相同底物相比，更倾向于磷酸化膜底物。如果野生型PKA-C-EGFP表达（MPPI东北，PKA-C=9.9±1.7，MPPIF/I，PKA-C=7.1±1.3；). 然而，当nmPKA-C-EGFP被表达时，MPPI显著降低，尽管EGFP-GluA1仍然优先磷酸化（MPPI东北，nmPKA-C=2.9±1.0，MPPIF/I，nmPKA-C= 3.0 ± 0.4; 两者p<0.001，c.f.野生型；). 内源性肉豆蔻酰化PKA活性和nmPKA-C的残膜亲和力()可能是这个剩余偏好的原因。总之，这些结果表明肉豆蔻酰化在PKA-C优先磷酸化膜底物的能力中起着关键作用。
PKA-C肉豆蔻酰化对PKA调节突触功能和可塑性很重要
PKA-C肉豆蔻酰化对神经元功能重要吗？我们通过进行两个独立的实验来解决这个问题。首先，已知PKA在调节突触可塑性中起重要作用(埃利希和马利诺，2004年;托马斯等人，1996年;Tzounopoulos等人，1998年;Weisskopf等人，1994年;Yasuda等人，2003年). 我们在培养的海马切片的CA1神经元中用PKA-RIIβ过表达野生型或非肉豆蔻酰化的PKA-EGFP，并使用双光子谷氨酸在斜顶端树突的单个棘上解封来触发单棘结构长时程增强（LTP）(松崎等人，2004年). 当野生型PKA-C表达时，谷氨酸去钙触发激活树突状棘体积的长期增强，但不触发相邻对照棘的体积（增强=73±18%（受刺激棘），−7±8%（对照棘），n=9，p<0.001）(). 增强幅度与GFP转染的对照神经元无明显区别（增强=82±28%，n=5，p=0.8，c.f.野生型PKA-c）(). 然而，如果nmPKA-C-EGFP被表达，这种增强作用几乎被消除（对于激活的脊髓，增强作用=14±9%，n=10，p<0.01 C.f.野生型PKA-C）。nmPKA-C的这种主要作用可能是由于胞浆中不希望的较高PKA活性，尽管也可能有其他解释。不管机制如何，神经元可以耐受野生型PKA-C的表达，但不能耐受非肉豆蔻酰化PKA-C，这一事实表明肉豆蔻蔻酰化PKA-C在功能上的重要性。
PKA-C的N-末端肉豆蔻酰化是支持正常突触可塑性所必需的（A） 代表性图像，（B）集体时间进程，以及（C）持续增强程度，如在面板B中阴影时间点处测量的。面板A中的灰色圆圈表示未覆盖位置。如图所示，用EGFP、PKA-C-EGFP/RIIβ/mCherry或nmPKA-C-EGFP/RII-mCherry转染神经元。（D，E）将代表性迹线（红色）归一化为来自邻近未转染CA1神经元的成对AMPA（D）和NMDA（E）电流的对照（蓝色）和散点图，这些神经元与转染sh-PKA-C（标记为shRNA）的神经元和指示的shRNA-resistance拯救结构配对。采用配对t检验检验统计显著性。另请参见图S7.
其次，为了研究内源性PKA的肉豆蔻酰化在调节突触传递中的作用，我们开发了一种shRNA结构（sh-PKA-C）来选择性地敲低PKA-Cα亚单位(图S7A). PKA促进AMPA受体的突触插入(Ehrlich和Malinow，2004年). 与成对的相邻未转染神经元相比，表达sh-PKA-C的神经元表现出明显更低的AMPA受体电流（图7D1，S7B、S7C和S7D). 还观察到微型兴奋性突触后电流（mEPSC）的振幅略有下降，但频率没有下降(图S7E、S7F和S7G). 虽然已知PKA也能调节NMDA受体(Murphy等人，2014年;Scott等人，2003年;Tingley等人，1997年)，PKA敲除对NMDA受体电流的影响较小，且无统计学意义(p=0.16，n=15）。因此，AMPA/NMDA电流比降低(图S7D). 作为突触前功能指标的配对脉搏比（PPR）没有改变(图S7H和S7I). 通过联合表达抗shRNA的PKA-C-EGFP结构（r.PKA-C），降低了AMPA电流和AMAP/NMDA电流比(图S7A,和S7D系列)，但如果在挽救结构中取消肉豆蔻酰化（r.nmPKA-C）(和S7D系列). 这一结果表明肉豆蔻酰化对PKA调节突触功能至关重要。总之，PKA肉豆蔻酰化似乎对PKA对突触功能和结构可塑性的正常调节很重要。
讨论
PKA-C的活化依赖性易位到细胞膜，修正了普遍存在的PKA作用模式，在该模式中，释放的PKA-C被认为保留在胞浆中。尽管最近co-IP被用来表明在刺激β肾上腺素能受体后，HEK细胞中大多数PKA-C仍然与PKA-R结合(Smith等人，2013年)，该实验不能排除PKA-C分子的一部分被释放。在大脑中，神经调节剂的突触释放可能导致局部高浓度（>=100μM）的去甲肾上腺素和多巴胺(考特尼和福特，2014年;Ford等人，2009年). 与HEK细胞相比，神经元也可能表达更高水平的PKA激活途径成分，如肾上腺素能受体、G蛋白和腺苷酸环化酶，以促进PKA激活和释放（c.f。和图S1). 目前的结果表明，在去甲肾上腺素刺激下，至少有一部分（>10%）的PKA-C在海马CA1神经元中留下PKA-R/AKAP复合体，其浓度远低于神经元可能经历的最大浓度(). 一旦PKA-C离开PKA-R，其活性增加50倍以上(Beavo等人，1974年;宫本茂等人，1969年;Reimann等人，1971年). 因此，10%的PKA-C释放可能导致激酶活性增加5倍以上。
这一修正模型解释了为什么活化的PKA-C在树突棘中富集() (Zhong等人，2009年)：与树突状轴相比，棘具有更高的膜-细胞溶质比率。该模型也与目前对PKA如何实现其特异性的理解相一致。AKAP建立PKA的初始空间定位和特异性。然而，PKA-C释放后如何维持这种特异性尚不清楚。释放的PKA-C的膜结合可能以多种方式增强PKA的特异性。首先，膜成为PKA信号传导的独特隔间。几项研究表明，PKA激酶在质膜上的活性较高(Castro等人，2010年;Terrin等人，2006年). 尽管这些结果被归因于膜附近较高的局部cAMP浓度，但我们的发现表明，释放的PKA-C的固有膜亲和力也可能起作用。其次，膜相关PKA-C的移动速度比典型的细胞溶质蛋白慢(). 这可能是由于PKA-C沿膜扩散时膜的高粘度所致，尽管不能排除PKA-C在胞浆内扩散，并且膜的结合限制了PKA-C的扩散可用性。无论确切的机制如何，低迁移率都会促进信号的分区。第三，尽管PKA-C的膜亲和力不需要AKAP，但完整PKA的AKAP锚定可能会影响释放的PKA-C插入的位置。一旦PKA-C插入膜中，PKA-C从一个膜结构移动到胞浆或不连续膜结构的可能性就会降低，从而维持AKAP介导的PKA特异性。最后，虽然PKA-C的膜结合可能不是维持PKA特异性的唯一机制，但它证明了AKAP下游磷酸化特异性机制的存在及其在细胞功能中潜在的重要作用。
释放的PKA-C的膜结合主要由N-末端肉豆蔻酰化介导。在晶体结构中，发现肉豆蔻酰基团折叠成PKA-C内的疏水口袋(Zheng等人，1993年). 其他研究表明，肉豆蔻酰化的一个功能是增强蛋白质的稳定性(Herberg等人，1997年;Yonemoto等人，1993年). 这些发现，再加上PKA-C似乎是高度可溶的(Johnson等人，2001年)导致普遍认为PKA-C是一种细胞溶质蛋白。然而，也有人认为，当PKA-C与II型PKA-R结合或当其在11位丝氨酸残基处磷酸化时（S11），肉豆蔻酰基团会暴露出来(Gaffarogullari等人，2011年;Gangal等人，1999年;Zhang等人，2015年)，并且当暴露时，肉豆蔻基可以插入重建的脂质双层中(Gaffarogullari等人，2011年;Struppe等人，1998年;Zhang等人，2015年). 然而，这种修饰是否以及在什么情况下将PKA与膜联系起来仍不清楚体内例如，有人建议II型PKA全酶可以与重组脂质双层结合(Zhang等人，2015年). 相反，我们的研究表明，释放的PKA-C（而非完整PKA）与活神经元的膜相关。这意味着PKA-C的肉豆蔻酰基团可以在没有PKA-R的情况下暴露出来。此外，S11似乎在膜靶向作用中发挥了相对较小的作用：取消该磷酸化位点（S11A）只会适度缩短脊椎停留时间（速度加快30%，)磷酸化修饰突变体S11D的移动速度甚至略快于S11A突变体().
PKA-C的膜亲和力可能处于可逆结合的中等范围。当PKA-C的N末端14残基替换为Src蛋白时，只提供了低水平的膜结合(Silverman和Resh，1992年). 这与普遍观点一致，即肉豆蔻酰化通常需要第二个脂质亲和基序来进行膜靶向。如果存在这样的基序，也可以解释nmPKA-C中的残余膜亲和力(). PKA-C的N末端47残基足以减缓蛋白质扩散()并与膜结合()，表明第二个脂质亲和基序可能存在于该PKA-C片段中。无论第二个基序是否存在，神经元树突富含膜，这可以弥补有限的膜亲和力。与膜的有限亲和力在PKA信号的终止中也很重要，因为释放的PKA-C最终必须在胞浆中返回到PKA-R。
我们的结果表明，大多数释放的PKA-C位于树突中的膜上，因为尖晶石-滞留时间衰减曲线很好地拟合为一个单指数()这表明没有显著比例的快速扩散PKA-C。同时，不能排除一小部分释放的PKA-C仍留在胞浆中。我们的数据还表明，质膜是活化PKA-C的主要位置之一（例如。，). 然而，PKA-C可能也与细胞内膜（如ER）有亲和力。另一方面，尽管直接膜结合是我们数据的最简单解释，但我们不能排除PKA-C实际上以肉豆蔻酰化依赖的方式与丰富的膜分布蛋白结合的可能性，尽管这样的蛋白质之前还没有文献记载。
PKA-C是如何调节胞质溶胶中的底物的？可能有几种机制。首先，如上所述，PKA-C的肉豆蔻酰基团可能对膜具有有限的亲和力，PKA-C可能在膜和胞浆之间循环。其次，细胞溶质蛋白可能会短暂地到达细胞膜，被磷酸化，然后回到细胞溶质。第三，并非所有PKA-C在强烈刺激时都会离开PKA-R，但未释放的PKA-C可能表现出一定程度的活性(Smith等人，2013年). 还应注意的是，在大脑的某些部位，在整个大脑中处于低水平时，除了肉豆蔻酰化PKA-C外，还表达了缺乏肉豆蔻醇化位点的PKA-Cβ亚基的选择性剪接变体(Guthrie等人，1997年). 虽然这些非肉豆蔻酰化PKA-C变体的确切数量和功能尚不清楚，但它们可能有助于细胞溶质底物的磷酸化。在任何情况下，细胞溶质AKAR5仍然可以被PKA磷酸化，尽管其敏感性低于膜滞留AKAR5。另一方面，为什么PKA磷酸化胞浆AKAR5而很少磷酸化GluA1c（参见。和)? 不同底物对PKA磷酸化可能有不同的敏感性（例如，参见(Beavo等人，1974年b)). 在AKAR5中，磷酸-残基结合域可以保护该位点免受磷酸酶活性的影响，因此随着时间的推移，适度的PKA活性可能会整合，从而导致传感器的显著磷酸化。
解放前PKA-C的分布情况如何？在其失活状态下，PKA-C与PKA-R结合，PKA-R又与AKAP结合。在神经元树突中，最丰富的AKAP是微管结合蛋白MAP2(Zhong等人，2009年). 因此，大多数PKA可能存在于胞浆中，并固定在微管上(). 这与野生型PKA静止时的MEI小于神经元树突中的统一性这一事实相一致(). 总的来说，我们的结果表明了对PKA催化亚单位在神经元中如何发挥作用的修正观点。
实验程序
质体构筑
使用标准诱变和亚克隆方法构建。请参见补充实验程序了解每个构造的详细描述。所有之前未发表的结构及其序列将在接受手稿后保存给Addgene。
细胞培养、转染和生物化学
HEK 293细胞和皮层神经元的原代培养(Xu等人，2010年)按照标准方案制备，并分别使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）和电穿孔转染。Co-IP实验按照标准程序进行，使用适当的抗体和磁性蛋白G珠（生命科技Novex 10007D）。使用7%固定或7-10%梯度聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白质印迹，并用LI-COR Odyssey扫描仪进行检测()或化学发光。请参见补充实验程序了解详细信息。
成像、开盖和电生理
如前所述，进行包括2pFLIM在内的成像(Harvey等人，2008年;Yasuda等人，2006年;Zhong等人，2009年)使用ScanImage软件控制的自定义设置(Pologruto等人，2003年).
使用由MATLAB编写的自定义软件控制的MultiClamp 700B放大器（分子器件）进行全细胞电压灯记录。电生理信号在2 kHz下过滤，在20 kHz下数字化。用含有4 mM Ca和4 mM Mg的人工脑脊液（ACSF）灌注切片。内溶液（以mM计）含有132 Cs-葡萄糖酸盐、10 HEPES、10 Na-磷酸钠、4 MgCl2、4 Na2-ATP、0.4 Na-GTP、3 Na-天冬氨酸盐、3 QX314、0.2 EGTA，渗透压为295 mOsmol/kg。为了减少复发活动，在CA1的两侧切下培养的海马脑片，所有记录实验中均存在4μM 2-氯腺苷（Sigma）。10μM GABAzine（SR 95531，Tocris）也用于抑制GABA电流。
有关更多详细信息，请访问补充实验程序.
数据分析、演示和统计
使用MATLAB编写的自定义软件进行图像分析。请参见补充实验程序了解详细信息。除非另有说明，否则平均数据以平均值±SEM表示。n表示实验次数。除非另有说明，否则p值是通过方差分析得出的。在所有数字中，*：p<=0.01和**：p<=0.001。
