抗体验证

摘要

介绍

抗体是最常用的研究工具之一，通常用于Western blot（WB）、免疫沉淀（IP）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、定量免疫荧光（QIF）和免疫组织化学（IHC）。它们也是临床管理的重要工具，广泛应用于实验室医学（ELISA分析和流式细胞术）和解剖病理学（IHC）。在解剖病理学中，IHC是一种诊断、预测和预测方法，IHC-读数直接影响临床环境中患者的管理。例如，IHC对乳腺癌患者雌激素受体α（ER-α）和人表皮生长因子受体2（HER2）的评估是确定患者是否接受每年高达10万美元的治疗的决定性测试。因此，在临床和研究实验室中，仔细准确地验证抗体试剂对于正确的结果至关重要。

基于抗体的检测对临床决策的影响导致了一些出版物，这些出版物强调了此类检测标准化和抗体验证指南制定方面尚未满足的需求(1–8). 尽管许多团体已明确表示有必要，但在基于抗体的测试中，没有公认的最佳实践指南。克莱夫·泰勒（Clive Taylor）和大卫·达布斯（David Dabbs）等世界领导人撰写了许多关于这一主题的书籍，最近，一个特设小组发表了一系列“建议”(2). 然而，这些工作侧重于IHC的临床方面，通常使用主观标准，并且往往没有利用允许对抗体进行更多定量评估的最新科学进展。相反，还有其他小组使用表面等离子体共振对抗体进行了严格的生物学评估(9)甚至与抗原结合的抗体的X射线结晶(10)常规研究或临床环境无法实现的方法。验证所用方法的广泛严谨性和方法论可能是导致对单一抗体验证方法缺乏共识的原因。在这里，我们概述了抗体验证方法以及与验证失败相关的缺陷。这项工作特别侧重于评估福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织的预后和预测癌症相关生物标记物。

什么是抗体验证？

FDA将验证定义为“通过使用特定实验室调查证明分析方法的性能特征适合其预期分析用途的过程”(www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM070107.pdf). 对于抗体，必须证明其在使用环境中具有特异性、选择性和可复制性。当涉及到IHC时，由于影响FFPE组织染色的分析前、分析和分析后因素的数量众多，标准化可能相当具有挑战性。固定时间可变、固定时间不足、使用的固定剂不同以及组织处理都会影响组织抗原性(5,11). 抗体克隆和稀释、抗原检索、检测系统和使用不同截止点的结果解释也是调节IHC测量的重要变量(三,12)（V.K.A.，未发布数据）。在这里，我们重点关注分析因素，并强调适当的抗体验证的重要性，特别是对于IHC或QIF的使用。

抗体研究中的常见陷阱

非特异性抗体

Michel等人最近发表的一篇社论(13)强调49种针对19种G蛋白偶联受体亚型的抗体缺乏靶向特异性，需要更严格的抗体验证标准。作者强调的例子包括缺乏M蛋白偶联受体的双敲除小鼠₂和M_三毒蕈碱受体亚型仍为M阳性₂和M_三受体抗体(14)和三个α基因敲除小鼠₁-肾上腺素受体亚型显示出与野生型小鼠相似的染色模式(15).

确定抗体的特异性在一定程度上取决于免疫原的类型：合成肽或纯化蛋白。合成肽的优点是可以知道抗体结合的氨基酸序列；然而，这些肽并不一定能重述天然蛋白质的三维结构或翻译后修饰(16). 因此，当蛋白质处于天然构象且具有完整的三维结构时，针对合成肽产生的抗体可能无法正常工作。此类抗体可能对IP或IHC实验无效，但在运行SDS-WB时，可能会在感兴趣的蛋白质完全变性后结合该蛋白质。相反的情况也可能发生，特别是如果免疫原是纯化的蛋白质，其中抗体对天然构象的蛋白质起作用，但在变性时不起作用。因此，WB不能作为IHC或其他抗原为天然构象的检测中抗体结合的绝对标准。

固定组织的方法使天然确认与变性确认更加复杂。未暴露在天然蛋白质中的表位可以暴露在固定组织中，反之亦然，即使它们可能没有真正变性。因此，抗体可以识别新鲜组织中的一个表位，但当应用于固定组织时，可以识别另一个表位数(17,18). 一个典型的例子是BCL-2（41–54个氨基酸）上的表位，当BCL-2存在于细胞质中时，表位会暴露出来，但很可能由于与其他蛋白质的相互作用而无法进入核室(19). 然而，当BCL-2在靠近表位的位置被磷酸化时，表位变得可用，就像从细胞中提取蛋白质或用SDS变性时所看到的那样(20).

单克隆抗体与多克隆抗体的选择使表位特异性问题更加复杂。多克隆抗体代表一组针对免疫原的抗体，通常在一系列不同条件下显示出较高的检测概率，而单克隆抗体更可能只在一组条件下工作。然而，多克隆抗体可能包含优越的亲和力克隆。也许最好的例子是FDA批准的Dako的Herceptest抗体，这是乳腺癌HER2检测的行业标准(21). 单克隆抗体更纯，因为它们是由产生免疫球蛋白的融合细胞的单个克隆产生的。然而，这些克隆可以在宿主动物中生长，在宿主动物体内收集含有分泌抗体的腹水(16,18); 因此，这些抗体制剂可能被感兴趣的单克隆抗体以外的抗体污染。Spicer等人的一项研究表明，他们分析的20种单克隆抗体制剂中有7种（35%）的染色模式定位于高尔基池，与抗体的抗原特异性无关，其中5种交叉反应抗体甚至不能染色感兴趣的抗原(22). 我们实验室的抗体验证工作表明，即使在单克隆抗体中，也同样缺乏特异性。图1提供了在我们实验室测试的非特异性抗体的两个示例图1A用小鼠HoxA1多克隆抗体（B01P；Abnova，台北市，台湾）通过WB检测10个细胞系的裂解产物。预期分子量为37 kD，在CaCo2裂解物中看到了此大小的条带（用箭头表示）。所有的裂解产物在较低信号水平上均显示出高于和低于预期分子量的几个条带，因此，如果该抗体仅针对转染过表达HoxA1的细胞系进行验证，这些条带可能会丢失。WB所看到的这种噪音水平引发了对非专业性的担忧。图1B提供了乳腺癌组织上HoxA1抗体染色模式的典型示例。同源盒转录因子的主要细胞质染色表明，该抗体不应用于IHC或IF方法。图1C提供了磷酸化-4EBP1的单克隆抗体的示例（兔MAb，克隆236B4；Cell Signaling Technology，Beverley，MA，USA），显示预期分子量的条带（用箭头表示）以及较高分子量的许多附加条带。图1D是当p-4EBP1的预期定位是细胞质时，在FFPE肺癌组织上使用该抗体进行IHC时观察到的核染色的代表性例子。

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图1

HoxA1和磷酸化-4EBP1的非特异性抗体示例

（A） 细胞裂解物变性并通过SDS-PAGE分离，转移到硝化纤维素中，并用抗HoxA1的小鼠多克隆抗体进行印迹。在CaCo2裂解物中可以看到预期分子量的条带（由箭头标记）。请注意，所有细胞系中的许多条带的分子量都出乎意料。（B） HoxA1在FFPE乳腺癌组织上的IHC染色的代表性示例。注意核转录因子的细胞质染色。（C） 磷酸化-4-EBP1的蛋白质印迹。箭头表示预期分子量的带；同样，所有裂解物在意料之外的分子量下都显示出许多条带。（D） 在FFPE肺癌组织上进行IHC染色以检测p-4EBP1的典型示例。请注意，蛋白质主要定位于细胞核和细胞质。

非再生抗体

抗体批次之间的相关性差是值得关注的问题，正如我们实验室最近对Met酪氨酸激酶受体抗体的研究所证明的那样(23). 引人注目的是，在688例乳腺癌患者的阵列上染色的两个不同批次的单克隆3D4 Met抗体显示出相反的染色模式——一个是核，一个是膜和细胞质，两个批次之间的回归具有R（右）²值0.038(23). Grimsey等人（2008年）证明了另一个不可再生抗体的例子，其抗体可能针对大麻素CB₁受体。作者通过WB和IF检测了来自不同商业来源的多种抗体，以对抗转染有HA标记CB的HEK细胞₁受体。在所测试的六种抗体中，只有两种显示出特定的膜染色，这种染色与使用抗HA抗体的检测共同定位。此外，对HEK细胞裂解物的WB分析表明，IF特异性较差的抗体检测到分子量不正确的蛋白质，或者根本没有蛋白质，或者存在于野生型HEK细胞中的蛋白质，这些蛋白质甚至不表达CB₁受体(24).

一些非再现性的例子可能非常微妙。图2显示了两个具有预期定位的特定染色示例。然而，在TMA（代表相同的患者组织）的连续切片上用相同的条件染色，显示出极低的相关性。VEGF是一种分泌性生长因子，因此，我们希望用VG-1克隆对患者组织进行细胞质染色(图2A). 在同一组织芯片的连续切片上用相同批次的抗体染色是不可重复的R（右）²值0.016(图2B).

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图2

VEGF VG-1克隆抗体缺乏再现性

（A） VG-1（1:50稀释）对FFPE肺癌组织的IHC显示预期定位的特异染色。（B） VG-1（1:50）染色的肺TMA连续切片彼此无关。相同患者组织连续切片的（C，D）IHC染色在第1次运行（C）中显示高阳性，在第2次运行（D）中VEGF为阴性。插图表示肿瘤的细胞角蛋白染色，以供参考。

抗体验证的当前实践

基于供应商的商业抗体验证

据估计，有180多家抗体公司为研究和临床市场生产了350000多种抗体(www.antibodire-source.com/onlinecomp.html). 因此，有针对大量靶蛋白的商用抗体也就不足为奇了。当人们买了一个分离DNA的试剂盒时，通常可以放心地假设它最终不会净化蛋白质。然而，抗体的情况并非如此。仅仅因为制造商声称抗体对蛋白质Z具有特异性，并不一定意味着它只结合蛋白质Z而不结合一系列其他蛋白质(29,36). 2005年，Ramos-Vara指出，针对同一抗原的抗体信息因制造商而异，差异很大(16). 事实上，现在很明显，证明特殊性的责任在于买方，而不是卖方。不同的供应商提供不同级别的验证，这取决于他们在盈利和提供高质量之间平衡的方法。在本次审查中，我们试图将七家不同公司（以下简称公司1-7）提供的验证水平和信息量与随机选择的AMPKβ分子进行比较₁.由于180多家公司中只有7家是随机选择的，因此没有披露；此外，一些公司的验证级别因产品而异。如果可行，我们比较了数据表上磷蛋白特异性抗体的验证方案，因为这些需要另一水平的特异性和验证(37,38).

总的来说，我们发现了三个验证级别。公司1的磷酸化AMPKβ的验证最少₁多克隆抗体。其网站或数据表上没有现成的描述任何级别抗体验证标准的信息。数据表本身包含关于抗体的最低信息，包括目标的简要背景以及相应的参考文献、推荐应用和WB、IF和ELISA的起始稀释液。然而，没有提供在这些应用中成功使用的实例，并且所提供的参考文献中也没有使用过这种抗体。数据表还包括作为合成肽的动物宿主和免疫原来源，但不包括确切的肽序列，尽管该肽可作为封闭肽购买。数据表还警告说，这种抗体“可能”与相应磷酸化的AMPKβ发生交叉反应₂.

公司2-5的验证水平适中。这些公司也没有提供任何关于抗体验证程序的深入描述。数据表中都包含目标的背景信息以及免疫原信息。四分之三的公司包括使用的完整序列，第四家公司将磷酸化位点周围的区域确定为使用的序列。这些公司还提供了带有起始稀释液的推荐应用程序，并且所有公司都提供了至少一个抗体成功识别其目标的实例。WBs-无论是转染细胞表达目标，还是抗体与阻断肽的预培养，都是最常见的抗体验证示例。

公司6和公司7的验证水平最高。公司6描述了其磷酸特异性抗体的验证程序，以将WB分析纳入(我)多个细胞系(二)肽和磷酸肽竞争实验，以及(三)定点突变体的分析。它还努力通过组合两个或多个预先合格的单个批次来证明批次间的一致性，以创建每个批次，从而最大限度地减少批次间的差异。7号公司描述了他们对所有抗体的严格验证方案，包括通过WB、IP、IHC、IF、流式细胞术和ELISA测试每种抗体。它通过使用适当的激酶特异性激活剂或抑制剂（如可用）来验证抗体的特异性和再现性；针对一大组已知目标表达的细胞系进行测试；磷酸专一性的磷酸酶处理；与同型对照的比较；验证转染细胞、敲除细胞和siRNA处理细胞；利用阻断肽消除所有信号；验证正确的亚细胞定位或治疗诱导的易位；将新的抗体批次与以前的批次进行比较；提供最佳稀释液和缓冲液，并指定阳性和阴性对照细胞系。对于IHC，7号公司的抗体在石蜡包埋的细胞颗粒上进行测试，包括在细胞系接受已知的诱导信号改变的处理或用siRNA处理以阻止目标表达后产生的细胞颗粒。用磷酸酶处理组织，以额外测试FFPE组织的磷特异性。具有已知目标表达细胞系或调节表达处理的异种移植物被石蜡包埋，然后染色。

这些公司的数据表包括公司2-5的所有信息，以及成功使用其抗体的其他示例。例如，公司6包括所有经验证的应用的代表性数据以及推荐的抗体浓度，并包括流式细胞术、阳性对照细胞系上的免疫细胞化学（包括与磷酸肽或非磷酸肽孵育，以证明仅与磷酸肽存在信号缺失），阳性对照组织的IHC和阳性对照细胞系裂解物的WB也包括与磷酸或非磷酸特异性肽预培养后的检测，显示预期分子量的单一条带，仅在与磷酸特异性肽类培养后信号缺失。

从公司1购买的抗体（提供了最少的信息，没有成功使用该产品的实例）需要研究人员进行广泛验证，以证明结果仅描述了感兴趣的目标；该公司几乎没有提供保证其有效的方法。公司2-5都提供了有关各自抗体的更多信息，并包括至少一个产品成功用于其推荐应用中的一个实例，以及相应的阳性对照。虽然这显然比公司1的方法更可取，但这些抗体仍需要研究人员验证其在感兴趣的应用中的靶特异性和批对批的再现性。公司6描述了其用于确定其磷酸特异性抗体既特异又可重复的验证步骤。此外，对于每个推荐的应用，提供了成功使用的示例，并通过磷酸特异性阻断肽提供了相应的抑制。公司7提供了我们认为的抗体验证金标准。所述的广泛的内部测试提供了高度的信心，即它提供的抗体将适用于推荐用于特定抗体的所有应用。它还提供了更高的置信度，即所获得的结果对所述靶点具有特异性，并且在抗体批次中可重复。即使公司6和公司7提供了广泛的验证，研究人员仍有义务确认该产品在实验室感兴趣的细胞系或组织中产生了特定的、可重复的结果。事实上，即使是最好的公司也无法控制产品离开后会发生什么。运输过程中的问题、实验室到达时或到达后的不当储存以及使用过程中的抗体污染都是抗体检测的潜在错误源。因此，每次检测都应进行警惕和全面的控制。

用于IHC/QIF抗体验证的Rimm Lab算法

抗体验证没有统一或可执行的标准。与未经FDA批准禁止销售的药物不同，没有联邦机构管理可销售到抗体检测市场的药物。未来，我们可能会看到FDA进一步清除抗体，或对临床测试中使用的试剂进行更严格的标记和监管。然而，到目前为止，还没有通用标准。因此，我们提出了实验室解决验证问题的方法（Rimm实验室算法）。我们的方法没有得到任何管理机构或任何行业协会的批准或批准，因此我们没有大胆地将其称为“建议”。相反，我们提供的是我们认为在严格性和实验室经济性之间的折衷，从而为数据传播提供足够的证据。我们的抗体验证算法(图3)特别专注于IHC或QIF在石蜡包埋组织上的最终用途应用，但对于其他基于抗体的测定也同样有效或经过修饰。

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图3

用于IHC/QIF抗体验证的Rimm Lab算法

抗体验证的第一步是使用体外细胞系测试抗体特异性。步骤2（虚线下方）涉及对组织微阵列上的抗体（TMA）进行进一步验证，以确定分析运行和不同抗体批次之间的预期靶点定位和再现性。

我们的第一条证据表明抗体对感兴趣的目标具有特异性，这是由WB完成的。选择多种细胞系裂解物（或组织匀浆），理想情况下目标表达水平已知，以便分析阳性和阴性细胞系。实际上，我们通常不知道目标水平，而是随机选择细胞系系列。我们经常以这样一种方式选择细胞系，即我们怀疑某些细胞系对靶蛋白完全阴性（例如，使用成纤维细胞系作为上皮靶点）。当真阴性细胞系不可用时，或者当靶蛋白水平高度依赖于生长条件时，我们产生细胞系的裂解物，其中靶蛋白已使用RNAi或细胞系裂解物被敲除，对于转染过表达构建物的靶蛋白，裂解物通常为空。在最近的一个例子中，我们使用了诱导过表达（a.W.W.，未发表的数据）。使用siRNA帮助验证抗体的示例如所示图4Stathmin（兔单克隆；Epitomics，加州伯灵盖姆，美国），一种微管不稳定蛋白。通过WB分析模拟转染或转染干扰siRNA对照或Stathmin特异性siRNA的BT-20细胞的裂解物，证明Stathmin表达缺失(图4A). 转染打乱或Stathmin siRNA的BT-20细胞也被固定，IF显示Stathmin表达降低(图4B). 此外，当已知的靶激活剂和抑制剂可用时，在验证特定状态（例如磷酸化）的抗体时，也可以包括来自处理细胞的裂解物。仅在表达靶点的细胞系中识别正确分子量的单一条带（或多条带，如果预期蛋白的多个亚型与抗体相互作用），鼓励进一步验证用于IHC/QIF。证明与WB无结合的抗体在其天然构象中可能仍然对其预期靶点具有特异性，如果目标是与IHC/QIF一起使用，IP实验可以是确定抗体特异性的下一步。

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图4

siRNA降低Stathmin的表达

（A） 模拟24小时后BT-20裂解物的WB；控制干扰siRNA或Stathmin siRNA转染显示Stathmin水平的特异性降低。GAPDH用作加载控制。（B） BT-20细胞在转染后24小时用干扰对照或Stathmin siRNA固定在4%PFA中，IF加Stathmin显示Stathmin表达减少。

验证IHC/QIF抗体的第二步是在组织芯片（TMA）上对抗体进行滴度，该芯片由FFPE细胞系颗粒组成，与WB首次验证的相同细胞系相对应，此外还包括预期表达靶点的患者组织（有关TMA有用性的更多信息，请参阅参考文献39和40). 良好的抗体应具有以下特征：(我)它只会染色表达目标的细胞颗粒(二)染色水平将随着抗体稀释度的增加而降低，并且(三)它将展示一种表达模式，该模式与已发表文献中的生物学和力学数据一致。应使用ImageJ量化WBs，使用A3UA测量每个TMA斑点中的蛋白质表达水平，然后将前两个步骤中看到的目标表达进行量化，结果应显示出彼此之间的强相关性。满足这些条件的抗体示例如所示图5用于ER-α（1D5克隆；Dako，Glostrup，丹麦）。正如已发表的文献所预期的那样，患者乳房组织上的染色主要是核染色(图5A). ER表达水平不同的乳腺细胞系(图5B)以及重组ER蛋白的校准曲线，用WB进行分析，ER蛋白的表达（每μg负载细胞裂解蛋白的pg）与IHC测定的ER表达水平和A3UA定量的ER表达量进行绘图，显示出很强的相关性(R（右）²值0.91）(图5C).

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图5

ER-α抗体克隆1D5作为定量WB和IHC方法之间强相关性的一个例子

（A） 用1D5（1:50稀释）染色的FFPE MCF7细胞显示ER-α的预期核定位。（B） 一组乳腺癌细胞系的WB和1D5显示ER-a的不同表达。Puro细胞是稳定表达可诱导ER-α的MCF7细胞。β-微管蛋白作为负载对照。（C） 使用ImageJ对WB的ER-α表达进行量化，并与细胞裂解物对应的AQUA评分相关，显示出很强的相关性。

验证任何应用的抗体的最后一步是证明抗体在分析运行之间和批次之间是可重复的。我们通过使用含有约120个斑点的TMA来实现这一点，这些斑点被每批抗体染色。对目标表达进行量化，并对每个点的两个得分进行回归。多批抗体之间的高度相关性是我们验证的最终要求。这方面的一个例子是MAP-tau抗体（美国马萨诸塞州Swampscott，美国），其中两个不同批次的抗体用A3UA定量，显示出高度相关性(图6A). 每次在不同的TMA上使用抗体时，将此对照TMA的切片平行染色，作为额外的染色对照。对照TMA载玻片应始终与之前的特定和可复制抗体实验具有高度相关性图6B显示了MENA（小鼠MAb，克隆21；BD转导实验室，新泽西州富兰克林湖）的种间再现性。

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图6

重复检测和抗体批之间的可复制抗体示例

（A） 在乳腺指数TMA上使用MAP-tau单克隆抗体显示了批对批的再现性。（B） 中东和北非有一个R（右）²当在我们的肺TMA连续切片上染色时，值为0.932，表明在不同的日子使用相同批次和稀释的抗体进行的检测中具有较高的重复性。

这些验证步骤相对快速且便宜，但最重要的是，它们是全面的。此抗体验证算法与许多其他先前发布的方法有点类似(13,18,36,41). 这些作者指出，抗体验证的最佳控制之一是来自完全缺乏抗原的敲除动物的组织。如果可用，这种组织将是对任何对照TMA的极好补充，但这并不是对所有感兴趣的蛋白质都可用，并且仅用于验证抗体的目的是一项耗时且昂贵的投资。理想的情况是，正如亚历山大·卡柳日尼（Alexander Kalyuzhny）最近提出的观点，总有一天我们会有关于抗体生成和使用的指南(42)所有公司都将被要求遵守高标准的抗体验证标准，研究人员可以更加自信，他们宝贵的拨款或临床收入不会浪费在标签不准确的“小瓶PBS”上(36). 然而，与此同时，研究人员或实验室主任最终有责任确保其实验室中使用的抗体的特异性和再现性得到验证。

致谢

脚注

工具书类