摩尔细胞。2012年2月29日;33(2): 111–116.
小鼠Pcna基因座一种非编码RNA的鉴定与表征
,1,4 ,1,3中,4 ,1,2 ,1和1,2,*
李智燕
1首尔延世大学医学院胚胎学实验室解剖学系,邮编:120-752,韩国
阿卜杜勒·阿齐兹·汗
1首尔延世大学医学院胚胎学实验室解剖学系,邮编:120-752,韩国
惠云敏
1首尔延世大学医学院胚胎学实验室解剖学系,邮编:120-752,韩国
2韩国延世大学医学院Brain Korea 21医学科学项目,首尔120-752,韩国
王新南(Xinnan Wang)
1首尔延世大学医学院胚胎学实验室解剖学系,邮编:120-752,韩国
Myoung Hee Kim先生
1首尔延世大学医学院胚胎学实验室解剖学系,邮编:120-752,韩国
2韩国延世大学医学院Brain Korea 21医学科学项目,首尔120-752,韩国
1首尔延世大学医学院胚胎学实验室解剖学系,邮编:120-752,韩国
2韩国延世大学医学院Brain Korea 21医学科学项目,首尔120-752,韩国
三现住址:韩国浦项790-784浦项科技大学生命科学系
4这些作者为这项工作做出了同等贡献。
2011年8月9日收到;2011年11月15日修订;2011年11月29日接受。
摘要
关键词:双向启动子,共表达,基因调控,非编码RNA,Pcna
材料和方法
细胞培养和组织样本制备
小鼠C3H10T1/2间充质细胞、NIH3T3成纤维细胞、Lewis肺癌(LLC)细胞和B16F10黑色素瘤细胞在Dulbecco改良Eagle's培养基中培养(DMEM、,WelGENE Inc.,韩国)在37°C、5%CO中添加10%胎牛血清(FBS,WelGENE Inc.)和100μg/ml青霉素-链霉素(WelGEEN Inc.)2B16BL6黑色素瘤细胞在补充有MEM维生素、10%FBS和100μg/ml青霉素-链霉素的MEM(WelGENE Inc)中培养。从E13.5小鼠胚胎分离的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)在DMEM(10%FBS)中培养。为了控制细胞周期进程,NIH3T3细胞首先在无血清的DMEM培养基中饥饿72小时,然后如前所述,用10%的FBS刺激6、12、18或30小时(Jaskulski等人,1988年;Ottavio等人,1990年;Zerler等人,1987年). 为了获得小鼠样品,处死了四个月大的ICR雄性小鼠,解剖了大脑、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、小肠和睾丸等器官的组织,并立即在液氮中冷冻,直至使用。
总RNA的分离及RT-PCR基因表达分析
使用Trizol试剂(Invitrogen,美国)从培养细胞或小鼠组织中分离出总RNA。使用0.5μg总RNA通过反转录反应(ImProm)合成cDNA-二TM逆转录酶,Pro-mega,美国)。PCR扩增在以下条件下进行:94°C初始变性5分钟,然后94°C 30–35个循环30秒(变性),54°C 20秒(退火),72°C 1分钟(聚合)。引物序列如下:太平洋航空公司,5′-TGC TCT GAG GTA CCT GAA CT-3′(正向)和5′-TGC TTC CTC ATC TTC AAT CT-3′(反向);{“类型”:“entrez-notide”,“属性”:{“文本”:“AK007836”,“term_id”:“12841644”,“term_text”:“AK007836“}}AK007836、5′-TGG GAG TTT AGG CTG CAG TT-3′(nc-Forward,ncF)、5′-GTT AGG GAA AAC G CT CCG TA-3′(nc-Reverse1,R1)、5’-CAA GTA TAT GTG CCT GAT CCG-3′(nc-Reverse 1/2,R1/2)和5′-TCT TCC AGG ACT CAG GCA TT-3′;控制β-actin,5′-CAT GTT TGA GAC CTT CAA CAC CCC-3′(正向)和5′-GCC ATC TCC TGC TCG AAG TCT AG-3′(反向)。
荧光素酶报告质粒的构建
5′-侧翼区的最小启动子太平洋航空公司用正向引物(5′-CTA AGG ATG GAA ACT GCA GCC-3′)和反向引物(5'-AGG CCT ACA GCG ACA ACT ACT-3′)对该基因进行PCR扩增。将纯化的PCR产物(289 bp)连接到pGEM®-T Easy Vector(Promega)中,然后转化为DH5α活性细胞。通过限制性内切酶分析选择阳性克隆,然后使用生态RI位点产生质粒pGL3-uPCNA。通过测序确认插入物(ori+或ori−)的序列和方向。我们播种了4×105NIH3T3细胞/孔放入12孔板中,隔夜培养直至90%融合。用pGL3空载体或pGL3-uPCNA(ori+/-)以及使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)的pRL-TK载体转染细胞。转染24小时后,用PBS冲洗细胞,并用被动裂解缓冲液(Promega)进行裂解。使用Dual-Luciferase®reporter assay System(Promega)进行荧光素酶报告分析,并使用GLOMAX 20/20光度计(Promeca)进行测量。
致谢
这项工作得到了韩国国家研究基金会(NRF)2008-20058561(2010-0000155)和2010-0026759赠款的支持,部分还得到了韩国农村发展管理局(RDA)的生物绿色21计划(20070401-034-030)的支持。
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