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摩尔细胞。2012年2月29日;33(2): 111–116.
2012年1月2日在线发布。 数字对象标识:2007年10月10日/10059-012-2164-x
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PMID:22228179

小鼠Pcna基因座一种非编码RNA的鉴定与表征

摘要

AK007836编码由2个外显子组成的非编码RNA(ncRNA)。AK007836位于太平洋航空公司并以与…相反的方向转录太平洋航空公司分析了其表达模式。ncRNA和太平洋航空公司在中检测到表达体外体内细胞,显示出正相关。一个177 bp的区域,分离太平洋航空公司AK007836具有双向启动子活性。当siRNA降低ncRNA的表达时,太平洋航空公司正常细胞中的表达也减少,但癌细胞中没有。这些结果表明,ncRNA是从双向启动子分化转录而来的,正调控邻近的蛋白编码太平洋航空公司基因转录,而这种调节功能在癌细胞中受到某种程度的破坏。

关键词:双向启动子,共表达,基因调控,非编码RNA,Pcna

简介

增殖细胞核抗原(PCNA)是DNA聚合酶δ的辅助蛋白,在DNA复制和修复、细胞周期进展和细胞分化中发挥作用(Maga和Hubscher,2003年). 的转录水平PCNA公司增长受到调控(Baserga,1991年;Jaskulski等人,1988年)这种调控受转录和转录后机制的控制(Baserga,1991年;Chang等人,1990年). 为了理解PCNA基因表达的调控机制,对不同长度和内含子的启动子进行了深入研究,并确定了调控区的独特性质(Alder等人,1992年;松冈等人,1993年;Ottavio等人,1990年;Pietrzkowski等人,1991年). 就人类PCNA而言,第一和第四内含子对PCNA的表达具有负调控作用(Alder等人,1992年;Ottavio等人,1990年). 通过Northern印迹分析,在人类PCNA基因座发现了一个500–600 bp长的反义PCNA转录物(PCNAAS),后来有报道称该转录物是由位于第一内含子内的启动子转录的,没有编码能力(Tommasi和Pfeifer,1999年). 由于反义RNA碱基对与PCNA的第一个编码外显子配对,PCNAAS的功能被认为可以诱导PCNA在G0/G1期沉默,而第一内含子+583处S相特异性转录因子E2F的结合可能在从负调控向正调控转变中起关键作用(Tommasi和Pfeifer,1999年). 尽管实验结果和计算结果之间存在大小差异,但当前版本的UCSC人类基因组浏览器查看384 bp非编码RNA(ncRNA),“PCNAAS”由单个外显子直接与人类PCNA基因的第一外显子重叠组成,这并不奇怪。

20世纪90年代初,还克隆了小鼠Pcna基因,并对其核苷酸序列进行了分析(山口等,1991年). 它的启动子位于转录起始位点上游的一个200 bp区域内,在该区域内有几个假定的转录调控元件。在小鼠Pcna基因中也发现了负调控区(NRR)(松冈等人,1993年). 然而,小鼠NRR(介于核苷酸−1231和−624之间)的位置与人类NRR的位置不同。此外,这两个物种之间没有明显的序列相似性。通过生物信息学分析,我们发现了一个反义非编码RNA(AK007836型)从小鼠Pcna基因座的5′上游区域转录。与NRR一样,这种非编码反义RNA的基因组位置和长度(AK007836)与人类PCNAAS完全不同,甚至有一个内含子。

因此,我们在本研究中进一步检测了小鼠ncRNAAK007836实际上会在正常小鼠组织或细胞系中与Pcna一起表达。由于Pcna的启动子正好位于AK007836以及Pcna和AK007836仅相隔177 bp,我们测试了启动子(最初报告为Pcna最小启动子)在两个方向的活性,证明该启动子是双向的,用于Pcna和ncRNA表达。最后,ncRNA的潜在功能AK007836在正常细胞和癌细胞中使用基于siRNA的基因敲除进行评估。

材料和方法

细胞培养和组织样本制备

小鼠C3H10T1/2间充质细胞、NIH3T3成纤维细胞、Lewis肺癌(LLC)细胞和B16F10黑色素瘤细胞在Dulbecco改良Eagle's培养基中培养(DMEM、,WelGENE Inc.,韩国)在37°C、5%CO中添加10%胎牛血清(FBS,WelGENE Inc.)和100μg/ml青霉素-链霉素(WelGEEN Inc.)2B16BL6黑色素瘤细胞在补充有MEM维生素、10%FBS和100μg/ml青霉素-链霉素的MEM(WelGENE Inc)中培养。从E13.5小鼠胚胎分离的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)在DMEM(10%FBS)中培养。为了控制细胞周期进程,NIH3T3细胞首先在无血清的DMEM培养基中饥饿72小时,然后如前所述,用10%的FBS刺激6、12、18或30小时(Jaskulski等人,1988年;Ottavio等人,1990年;Zerler等人,1987年). 为了获得小鼠样品,处死了四个月大的ICR雄性小鼠,解剖了大脑、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、小肠和睾丸等器官的组织,并立即在液氮中冷冻,直至使用。

总RNA的分离及RT-PCR基因表达分析

使用Trizol试剂(Invitrogen,美国)从培养细胞或小鼠组织中分离出总RNA。使用0.5μg总RNA通过反转录反应(ImProm)合成cDNA-TM逆转录酶,Pro-mega,美国)。PCR扩增在以下条件下进行:94°C初始变性5分钟,然后94°C 30–35个循环30秒(变性),54°C 20秒(退火),72°C 1分钟(聚合)。引物序列如下:太平洋航空公司,5′-TGC TCT GAG GTA CCT GAA CT-3′(正向)和5′-TGC TTC CTC ATC TTC AAT CT-3′(反向);AK007836、5′-TGG GAG TTT AGG CTG CAG TT-3′(nc-Forward,ncF)、5′-GTT AGG GAA AAC G CT CCG TA-3′(nc-Reverse1,R1)、5’-CAA GTA TAT GTG CCT GAT CCG-3′(nc-Reverse 1/2,R1/2)和5′-TCT TCC AGG ACT CAG GCA TT-3′;控制β-actin,5′-CAT GTT TGA GAC CTT CAA CAC CCC-3′(正向)和5′-GCC ATC TCC TGC TCG AAG TCT AG-3′(反向)。

荧光素酶报告质粒的构建

5′-侧翼区的最小启动子太平洋航空公司用正向引物(5′-CTA AGG ATG GAA ACT GCA GCC-3′)和反向引物(5'-AGG CCT ACA GCG ACA ACT ACT-3′)对该基因进行PCR扩增。将纯化的PCR产物(289 bp)连接到pGEM®-T Easy Vector(Promega)中,然后转化为DH5α活性细胞。通过限制性内切酶分析选择阳性克隆,然后使用生态RI位点产生质粒pGL3-uPCNA。通过测序确认插入物(ori+或ori−)的序列和方向。我们播种了4×105NIH3T3细胞/孔放入12孔板中,隔夜培养直至90%融合。用pGL3空载体或pGL3-uPCNA(ori+/-)以及使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)的pRL-TK载体转染细胞。转染24小时后,用PBS冲洗细胞,并用被动裂解缓冲液(Promega)进行裂解。使用Dual-Luciferase®reporter assay System(Promega)进行荧光素酶报告分析,并使用GLOMAX 20/20光度计(Promeca)进行测量。

siRNA转染和实时RT-PCR

AK007836和非特异性对照siRNA由Genolution(韩国首尔)设计和生产。siRNA验证的靶序列为5′-GTC GTC ACC GCC CAA GTT T-3′(siAK007836#1,siAK#1)、5′-CGG ATC AGG CAC ATA TAC T-3′(siAK007836#2,siAK#2)和5′-CCA ATG AGA ACC AAC CAA T-3′(siAK007836#3,siAK#3)。培养细胞,生长到30%的汇合处,转染20 nMAK007836根据制造商的说明使用G-Fectin试剂(Genolution)的siRNA或非特异性对照siRNA。转染24小时后,使用Trizol(Invitrogen)提取总RNA。使用一步法SYBR Primescript RT-PCR试剂盒(日本Takara)和SmartCycler系统(美国Cepheid)进行实时RT-PCR。用于扩增的引物序列如下:AK007836,5′-TGG GAG TTT AGG CTG CAG TT-3′(正向)和5′-CTG ATC CGT TAG GGA AAA CG-3′(反向);Pcna,5′-AGG AGG CGG T AA CCA TAG AGA T-3′(前)和3′-ACT CTA CAA CAA GGG GCA CAT C-3′(后)。对于半定量RT-PCR分析,使用Multi-Gage V3.0软件(Fujifilm)。

结果

AK007836最初报道为从10天龄雄性小鼠胰腺中分离出的cDNA,其大小为7550 bp,包含2个外显子,没有任何编码能力(图1A). 在这里,我们使用RT-PCR揭示了这一ncRNA转录物在两个小鼠成纤维细胞系C3H10T1/2和NIH3T3中的存在(图1B). 使用固定正向引物(ncF),位于不同外显子中的三个不同反向引物(R1、R1/2和R2)成功检测到ncRNA转录物的预期大小。特别是,位于第二外显子(R1/2和-R2)的反向引物的结果证明,内含子是从初级转录物中精确剪接出来的。

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小鼠ncRNA的基因组组织和表达分析AK007836.(A)AK007836位于与太平洋航空公司-轴承钢绞线。外显子太平洋航空公司AK007836分别用黑色和灰色方框标记,以及外显子编号。该基因的cDNA序列(外显子1和外显子2的一部分)AK007836转录本(ncRNA)和用于RT-PCR的引物序列如下所示。一个正向引物(ncF)和三个反向引物分别用粗体和粗体斜体书写。反向引物R1和R2分别位于外显子1和2。跨越外显子1和2之间的拼接连接的R1/2下划线。(B) RT-PCR分析AK007836在C3H10T1/2和NIH3T3细胞中。从两个细胞系中分离总RNA并用于RT-PCR。检测到一个正向引物和三个不同反向引物的组合AK007836内含子正确拼接的预期长度的转录本。

检测ncRNA的表达模式AK007836与Pcna一起,使细胞静止,然后重新刺激以促进细胞增殖。在缺乏血清的细胞中几乎检测不到Pcna mRNA,但在血清刺激后表达水平增加,在18小时达到峰值(图2A). 同样,刺激18小时后,在血清刺激时观察到ncRNA的峰值上调。当Pcna和ncRNA同时存在时AK007836检测了表达谱体内使用不同的小鼠组织,表达模式与检测到的相似体外,显示了AK007836表达和Pcna表达(图2B).

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共同表达太平洋航空公司AK007836 体外体内.(A)的表达模式太平洋航空公司AK007836用FBS刺激NIH3T3细胞。使细胞静止(0小时),然后刺激指定的时间(小时)。这个数字代表了三个独立的实验,都显示了类似的结果。(B) 从小鼠大脑、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、小肠和睾丸等不同器官中分离出总RNA,然后用于RT-PCR。所有分析均使用至少两种独立的源材料进行复制。(ncF-R2)表示用于扩增的引物ncF和R2AK007836.

在检测Pcna和AK007836由于ncRNA AK00 7836和Pcna的第一外显子仅相隔177 bp,因此我们在小鼠组织和培养细胞中测试了这两个基因是否存在一个共同的双向启动子。为了测试这个区域,据报道是Pcna最小启动子(山口等,1991年),也用于ncRNA表达,我们将该区域正向(pGL3-uPCNA-ori+)和反向(pGL3-uPCNA-ori-)克隆到pGL3-basic载体中(图3A). 该区域的转录活性在两个方向上都高于对照载体的1000倍以上(图3B)证明Pcna最小启动子在两个方向上都具有相同的功能,并且可能用于ncRNA表达。

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双向启动子分析。(A) 小鼠5′侧翼区核苷酸序列太平洋航空公司.基因组组织太平洋航空公司和ncRNAAK007836如上图所示图1。的上游区域太平洋航空公司(虚线框)包含的第一个外显子和第一个内含子的一部分AK007836下面放大了。先前报道的最小启动子区(−200)和负调控区(NRR,−1231~−624)(松冈等人,1993年)显示。−500到+150的核苷酸序列如下所示。的第一个外显子AK007836下划线。最小促进者太平洋航空公司用粗体书写,用于扩增最小启动子区域的引物序列用小写字母书写。转录起始位点(+1)和ATG起始密码子太平洋航空公司用粗体斜体标记。(B) 用pGL3-basic质粒或含有最小启动子的pGL3质粒转染NIH3T3细胞太平洋航空公司在正确方向(pGL3-uPCNA ori+)或反向(pGL3-uPCNA oi−),以及雷尼利亚荧光素酶质粒作为转染对照。转染24小时后测定荧光素酶活性。萤火虫萤光素酶活性与雷尼利亚荧光素酶活性表示为相对荧光素酶活性。进行了四项独立实验。数值表示为平均值±SD。*与pGL3-basic相比P<0.001。

虽然长ncRNAs的功能大多未知,但其中一些可能影响邻近基因的表达(Wilusz等人,2009年). 直接评估ncRNA的功能AK007836在Pcna表达时,我们转染siRNAAK007836然后检测Pcna的表达。NIH3T3和B16F10分别作为正常细胞和癌细胞的代表。siRNA充分抑制了AK007836型在NIH3T3和B16F10黑色素瘤细胞中(NIH3T_3和B16F-10分别减少72%和62%),并且在NIH3A细胞中显示Pcna转录减少。然而,有趣的是,AK007836抑制并不影响癌细胞B16F10中Pcna的表达(图4A). 为了排除siRNA在癌细胞中产生非靶向效应的可能性,我们测试了3种不同的siRNA对AK007836与siRNA#3的作用相比,siRNA#1和#2的结果在一定程度上取决于细胞类型和培养条件(图4B和4C)。4摄氏度). 由于siRNA#3具有相对较高的效率和重复性结果,我们使用siRNA#13进行进一步研究。使用两个正常细胞(C3H10T1/2和MEF)和两个癌细胞系(B16BL6和LLC)进行的附加实验表明,之前观察到的差异(图4A)是一种普遍现象(图4D)即ncRNAAK007836对正常细胞中Pcna的表达有积极影响,而癌细胞中的Pcna表达受到某种程度的干扰。

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的影响AK007836击倒太平洋航空公司表达式。(A)AK007836型将siRNA或非特异性对照siRNA以最终浓度20 nM转染到NIH3T3和B16F10细胞中。24小时后,提取总RNA并用于实时RT-PCR。使用β-肌动蛋白使每个样本中的基因表达水平正常化。根据对照siRNA处理样品的值计算还原百分比。每个实验使用在不同时间分别制备的细胞重复三次。(B) 设计了三种靶向不同基因组序列的siRNA,并对其效率进行了测试AK007837公司抑制三种不同的癌细胞株LLC、B16F10和B16BL6。以最终浓度20 nM转染siRNAs并培养24 h。RT-PCR结果进行半定量分析。(C) (B)的代表性凝胶图像。(D) 为了确定太平洋航空公司表达式依据AK007836敲除在癌细胞中被明确废除,使用si_AK007836#3测试了两个正常(C3H10 T1/2和MEF)和两个癌细胞(B16BL6和LLC)。数据是三个独立实验的代表。

讨论

据报道,大多数真核生物基因组(超过90%的基因组DNA)被转录为RNA,没有任何编码能力(科斯塔,2005年;2010). 虽然非编码RNA(ncRNAs)的各种功能在许多生物系统中都有牵连,但其中大多数仍有待证实。因此,必须发现新的ncRNAs并进一步描述其作用模式,以便更好地理解其生物学意义。

在Pcna基因组位点的上游区域,已在人类和小鼠中报告了一种非编码RNA。人类非编码RNA(PCNAAS)的基因组位置和作用机制已在前面定义(Tommasi和Pfeifer,1999年). 然而,到目前为止还没有关于在小鼠Pcna位点鉴定和鉴定非编码RNA的报告。

在这里,我们证明了这一点AK007836包含一个内含子,位于小鼠Pcna位点附近,从Pcna的相反链表达为ncRNA体内以及体外(图1和2)。2). 正确剪接形式的ncRNA的表达AK007836由血清刺激及其邻近的蛋白编码基因Pcna诱导,可能共享一个共同的双向启动子(图2和3)。). 在人类中,ncRNA PCNAAS也被报道从PCNA的相反链表达。由于PCNAAS与PCNA基因重叠,PCNAAS可以与PCNA mRNA杂交。有趣的是,据报道,最小的人类PCNA启动子(−395 to−1)也是双向的(Rizzo等人,1990年). 由于PCNAAS的转录起始位点是PCNA下游的416个核苷酸,考虑到RNA pol II启动子位于基因上游,该双向启动子似乎不被RNA聚合酶(pol)II用于PCNA和PCNAAS表达。然而,我们不能排除RNA pol III表达PCNAAS的可能性,其启动子位于基因的下游;PCNA的RNA pol II和PCNAAS的pol III可能共享一个最小的双向PCNA启动子。由于PCNAAS与RNA pol III转录的大多数基因一样只有一个外显子,因此需要进一步研究以明确RNA pol II表达PCNAAS的可能性,我们在本研究中测试的Pcna的~200-bp 5′上游区域最初通过瞬态CAT报告分析被确定为Pcna活性最小启动子(山口等,1991年). 当我们通过将其克隆到荧光素酶报告载体来分析该启动子区域时,发现它是双向的(图3). 与人类PCNA不同,小鼠启动子位于ncRNA之间AK007836与Pcna相隔177 bp。因此,这种双向启动子很可能由Pcna和ncRNA以相反方向表达共享,这似乎在高等脊椎动物基因中很常见(Engström等人,2006年;Osato等人,2007年;Trinklin等人,2004年).

自ncRNA以来AK007836与Pcna的表达没有任何互补性,不像人类PCNAAS的功能是沉默Pcna,我们比较了Pcna和ncRNA的表达谱(图2). 当siRNA降低ncRNA的表达水平时,Pcna的表达也降低(图4)表明ncRNA在某种程度上对Pcna转录起积极作用。虽然正常细胞和癌细胞之间的遗传或表观遗传差异可能导致对RNAi的敏感性不同,但癌细胞(B16F10、B16BL6和LLC)的结果不同,仍然表明由ncRNA介导的调控系统在癌细胞中受到某种程度的破坏(图4)虽然精确的机制AK007836激活相邻编码基因表达尚不清楚,这可能是一类对基因表达有积极影响的长ncRNAs的一个例子(Feng等人,2006年;Lanz等人,1999年;Ørom等人,2010年;Shamovsky等人,2006年).

越来越多的证据表明,多种启动子相关的ncRNA,如启动子相关长RNA(PALR)、启动子相关短RNA(PASR)和启动子上游转录物(PROMT)等,参与蛋白质编码基因转录(抑制或激活)通过表观遗传修饰和转录干扰(卡尼奇,2010年;科斯塔,2010年;Han等人,2007年;Morris等人,2008年;Preker等人,2008年). 本文鉴定的双向启动子位于CpG岛(200 bp Pcna最小启动子中68%GC)。最近,一个富含GC的启动子被报道与无脊椎动物和脊椎动物转录起始位点(TSS)−60到+120 nt范围内的微小RNA映射相关(Taft等人,2009年). 据报道,微小的TSS相关RNA有助于启动子区域维持蛋白质编码基因的活性(Seila等人,2008年). 虽然我们不确定微小RNA是否在Pcna富含GC的启动子区域周围表达,但我们不能排除ncRNA的可能性AK007836可能与这些双向表达的微小RNA一起作用,如果有的话,影响Pcna的表达。

现在越来越清楚的是,ncRNAs是细胞中的关键调节分子,可以在基因组相近的情况下调节基因的表达或在远程靶点上起反式作用通过各种机制(安和宋,2011;Ponting等人,2009年). 考虑到PCNA/PCNA在细胞增殖和肿瘤进展中具有关键作用,有必要了解其功能、调节和进化起源,以及影响PCNA/PCNA基因表达的调节元件。自从许多非编码RNA被证明在包括癌症在内的各种疾病中被错误调控以来(Osato等人,2007年),我们努力定义ncRNA的生物学特性AK007836需要进一步分析ncRNA在PCNA/PCNA调控中的作用。

致谢

这项工作得到了韩国国家研究基金会(NRF)2008-20058561(2010-0000155)和2010-0026759赠款的支持,部分还得到了韩国农村发展管理局(RDA)的生物绿色21计划(20070401-034-030)的支持。

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文章来自分子和细胞由以下人员提供韩国分子和细胞生物学学会