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公共科学图书馆一号。2013; 8(9):e74608。
2013年9月18日在线发布。 数字对象标识:10.1371/日记本.0074608
预防性维修识别码:项目经理3776813
PMID:24058600

猪胃窦和胃底的紧张性和相性平滑肌收缩不受PKCα-CPI-17通路的调节

胡文慧,编辑器

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摘要

据报道,肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)通过蛋白激酶C(PKC)和17kDa PKC增强的肌球蛋白轻链磷酸酶抑制剂(CPI-17)进行调节,作为一种钙2+平滑肌(SM)中的致敏信号通路,因此可能参与强直性和时相性收缩。本研究检测了完整SM组织中PKCα和CPI-17的蛋白表达和时空分布。KCl或卡巴胆碱(CCh)刺激强直胃底SM产生持续收缩,而相态胃窦产生短暂收缩。此外,在1µM佛波醇12,13二丁酸盐(PDBu)刺激下,紧张性眼底产生的相对力大于相窦,据报道,PDBu可激活PKCα-CPI-17通路。Western blot分析表明,这种收缩差异不是由这两种组织之间PKCα或CPI-17蛋白表达的差异引起的。免疫组织化学结果显示,PKCα在胃底和胃窦的纵向和环形层中的分布没有差异,主要分布在SM细胞质膜附近。用1µM PDBu或1µM CCh刺激组织不会改变这种外周PKCα分布。CPI-17分布在这两种组织之间没有差异,但与PKCα分布不同,在放松组织条件下,CPI-17似乎在细胞质中弥散分布,但在用1µM PDBu或1µM CCh刺激组织时,在质膜处主要向外围分布转移。双重标记的结果表明,PKCα和CPI-17均未在膜上的粘附结合处(vinculin/talin)共定位,但它们确实相互共定位,并在膜上与小凹蛋白(caveolin)共定。这种差异的缺乏表明,PKCα-CPI-17通路与胃底和胃窦中观察到的强直性和时相性收缩无关。

介绍

决定强直(持续)与阶段性(短暂)平滑肌收缩的机制仍未解决。不同的神经支配和循环信号分子以及独特的受体和蛋白质(异构体)表达和细胞内信号通路使问题复杂化。不出所料,有多种假设被提出来解释SM中的张力维持,包括:缓慢或非循环的平滑肌肌球蛋白跨桥,称为闩桥[1],[2],[3],[4]; 非肌肉肌球蛋白II的补充[5],[6],[7]; 钙结蛋白或钙调素依赖性肌动蛋白-肌球蛋白交联的形成[8],[9]; 细胞骨架受力结构的形成[10],[11],[12]; 和肌球蛋白LC的调节20通过第二信使途径磷酸化影响肌球蛋白轻链激酶(MLCK)和肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)活性[13],[14],[15],[16],[17],[18]最后一类是有趣的,因为据报道这些第二信使蛋白在各种SM组织中的差异表达、定位和调节。MLCK和MLCP活性的可变调节不仅可以为Ca提供一种手段2+敏化,但也可能是强直性与阶段性收缩的机制。通过PKCα-CPI-17途径使MLCP失活,可以维持高肌球蛋白轻链(MLC20)磷酸化,从而产生持续的收缩力。MLCP失活失败会降低MLC20磷酸化和用力,导致短暂收缩。胃底SM产生紧张(持续)收缩,而胃窦SM产生阶段性(短暂)收缩,以响应各种刺激。

2+致敏,包括激活G蛋白偶联的第二信使通路,使收缩蛋白对[Ca]致敏2+ ]通过抑制MLCP,可以通过多种途径中的任何一种发生。已报道的抑制MLCP活性的途径之一包括蛋白激酶C/C激酶激活的17 kDa PP1抑制剂蛋白(PKC/CPI-17)途径[19],[20]G偶联蛋白受体(GCPR)激活导致磷脂酶C(PLC)激活,水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)生产肌醇1,4,5-三磷酸(IP)和二酰甘油(DAG)。众所周知,DAG可激活PKC,PKC可导致CPI-17磷酸化,选择性抑制MLCP(综述了内脏SM[17]). PKC被认为是由其在细胞内的激活和空间分布调节的,后者由锚定蛋白控制,锚定蛋白结合并限制PKC在细胞特定区域的位置[21],[22]例如,关于组成活性L型钙的报告2+PKC的通道及其调控[23],[24]提示PKC位于平滑肌细胞膜附近。CPI-17在细胞中的细胞功能可能因其蛋白表达水平以及其是否位于PKCα所在/激活的质膜附近,或与收缩性肌球蛋白粗丝相关,其中MLCP位于去磷酸肌球蛋白轻链20(MLC)20).

在Ca中,PKCα和CPI-17的表达及其在组织激活时的时空分布已经被提出2+平滑肌组织致敏(综述[14],[15],[16],[17]). 因此,它们的表达和细胞定位/易位的差异可能与确定紧张性与阶段性收缩反应有关。为了使这两种蛋白质成为组织激活期间抑制MLCP活性的途径的一部分,从而引起紧张或阶段性反应,它们需要以适当的水平表达,并在正确的时间定位在细胞中的正确位置。因为PKC被DAG(一种膜结合的磷脂)激活,所以它也必须至少在时间上在膜上才能发生。如果CPI-17会抑制MLCP去磷酸化MLC20在粗纤维上,CPI-17在某一点上需要存在于与粗纤维相关联的胞浆中。由于这两个步骤发生在细胞的两个空间上不同的区域,这些蛋白质中的一个或两个必须转移到另一个区域,以便它们相互作用并完成该路径。

本研究的目的是验证PKCα-CPI-17Ca2+敏化途径参与决定平滑肌的紧张(持续)和阶段性(短暂)收缩反应。为此,我们测定了在放松和激活条件下,PKCα和CPI-17在相态胃窦和强直胃底的蛋白表达和时空分布。结果表明,这两种蛋白的表达以及在这两种组织之间的外周分布均无显著差异,这与PKCα-CPI-17 Ca的假设不一致2+敏化途径是在这些组织中观察到的强直性与阶段性收缩反应的决定因素。

方法

器官和组织处理

猪组织(胃)取自Hansen Meat Service(Franksville,WI),并放入冷生理盐水(PSS)中;(单位:mM):140.1 NaCl,4.7 KCl,1.2 Na2高性能操作4,2.0 MOPS(pH 7.4),0.02钠2乙二胺四乙酸,1.2 MgSO4,1.6氯化钙2和5.6葡萄糖)。清除胃中的血液、松散的结缔组织,在某些情况下,清除胃粘膜,并立即冷冻或在冰箱中的PSS中保存0-2天。一些器官在尸检后尽快新鲜冷冻(60-90分钟)。一些器官在冷冻前的不同时间点在PSS中孵化和/或用1.0µM CCh或PDBu(Sigma)在37°C下刺激。还测试了不同的孵育时间和激动剂浓度。对于免疫组化,所有组织均冷冻保存,直至切片和免疫反应。在所有情况下,冷冻都需要将组织块或组织条放入在液氮中冷却的异戊烷中,然后在−80°C下储存。在Leica CM1900低温恒温器上切割5至6µm冰冻组织切片,在玻璃载玻片上取下并冷冻保存(0至1天),直至免疫反应。

免疫反应和试剂

使用的抗体来自以下来源:来自加利福尼亚州圣克鲁斯生物技术公司的PKCα(H-7和C-20)和CPI-17(H-60);来自密苏里州圣路易斯Sigma的Vinculin和Talin;Caveolin 1来自加利福尼亚州圣何塞BD Biosciences;来自宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch的Cy2和Cy3驴抗鼠或兔次级药物;Alexa Fluor 594-phalloidin和DAPI来自俄勒冈州尤金的分子探针。所有这些抗体以前都曾在我们的实验室中用于免疫组织化学和免疫印迹,它们对所示的相应蛋白质的正确分子量的条带具有特异性[25],[26],[27]。在不包括初级抗体的阴性对照组中,这些条带没有反应性,组织切片上也没有免疫荧光。

在室温下解冻玻璃载玻片上采集的冷冻组织切片,然后用2%多聚甲醛固定10分钟,在0.5%Triton X-100中渗透10分钟,并用5 mg/ml BSA封闭1小时,然后与主要抗体反应过夜(4°C)然后在室温下接种合适的二级抗体1小时。二级抗体后,用DAPI(0.5µM)、指骨肽(10–50 nM)或DAPI/指骨肽孵育组织,以适当染色细胞核和/或丝状肌动蛋白。在一次和二次孵育以及复染后使用多次洗涤。使用75%的甘油和0.2%的没食子酸正丙酯缓冲液安装玻璃罩,以尽量减少褪色。所有免疫反应溶液均用PBS-Tween制成[(g/升:NaCl 8.0,KH2人事军官40.2,钠2高性能操作41.15,KCl 0.2,),1%吐温-20,pH7.4],0.1%牛血清白蛋白。阴性对照包括0.1%的牛血清白蛋白,无一抗,无免疫反应。

显微镜

使用具有落射荧光照明的Olympus IX70显微镜观察切片。数字图像是用16位普林斯顿仪器公司(新泽西州普林斯顿市)的CCD相机拍摄的,通过PC上的IPLab for Windows通过PCI板进行控制(3.6版,Scanalytics;弗吉尼亚州费尔法克斯)。使用100×(1.3 NA)或60×(1.25 NA)油透镜或40×(0.9 NA)空气透镜拍摄图像,并存储在PC上。使用的发射过滤器为405、490和570 nm。使用尼康共焦显微镜(尼康A1共焦Eclipse Ti)观察切片。使用的物镜为100×(1.4NA)油透镜,波长分别为425、488和561nm。使用这两种不同的系统在免疫荧光分布中观察到类似的结果。

组织中单个细胞PKC/CPI-17分布的图像分析

在横切组织切片中对单个细胞进行荧光强度剖面。切片在低倍镜(10–20倍)下观察,以避免出现明显伪影(组织折叠、冷冻损伤等)。在无伪影区域,放大倍数增加到40–100倍,并在这些更高的放大倍数下拍摄照片。选择一个组织切片中的三个不同区域进行拍照。对于所使用的三个颜色通道中的每一个,分别采集Z堆叠序列。取1µm厚的Z切片,每个组织切片取15–25个Z切片(图S1&S2系列显示胃窦CPI-17免疫反应的Z堆叠示例(有组织激活和无组织激活)。对每个部分的每个Z堆栈序列进行检查,以确定中心Z图像,并将该图像转换为.bmp文件,该文件在PC上导入NIS-Elements AR 3.0(Nikon)以分析数据。

在横切组织切片中获得单个细胞的PKCα和磷脂酶原荧光强度的剖面图。在图像字段的中心画了一条线。选择十个与直线交叉的细胞进行测量。基于我们之前的协议[25]细胞两侧的前五个像素(~0.7µm),指骨样蛋白强度从基线急剧增加,被定义为细胞的外围。对于细胞溶质测量,在距离细胞外围至少2µm处放置一条线。使用大致位于细胞中心(用于细胞溶质测量)或沿细胞膜(用于外围测量)的感兴趣区域(ROI)进行强度测量。为了一致性,ROI的大小在外周和细胞溶质测量中保持不变。分析中排除了切片中直径很小(无法从边缘至少2µm处测量细胞溶质ROI)或存在细胞核的细胞(可见DAPI染色,其中空间限制和核周细胞器可能混淆分布)。对于PKCα,使用外围PKCα的平均强度与总PKCα强度的比值(外围ROI的PKCα密度与胞浆ROI的总和)。对每个组织区域的每个区域和三个不同区域的十个细胞进行测量以进行数据分析,即对每个样品的三十个细胞进行计数和平均(n = 1). 最终样本量为n = 5.同样的程序用于测量CPI-17的强度,除了每个样品只使用一个10个细胞的区域(n = 1) ,最终样本大小为n = 三。

机械测量

在使用之前,立即在每一端切割并夹紧薄纸条,夹子固定在固定金属杆上的挂钩和等距力传感器(马萨诸塞州霍利斯顿市哈佛仪器)之间,PSS中充满95%O2/5%一氧化碳2在37°C的水套肌肉室(加州蒙罗维亚Radnoti Glass Technology)中。通过重新定位固定的金属杆,可以改变每条带材的长度。

将平滑肌组织条(胃窦和胃底)平衡1 h,并使用简化的长度-张力曲线拉伸至近似Lo的被动张力。为了收缩组织,PSS被替换为K+-PSS(109mM KCl以等渗法取代NaCl)[28]在每次激活之间,随着组织的拉伸,肌肉条被反复激活,直到最大力不再比之前的收缩明显增加。每次组织激活后,用PSS冲洗腔室三次。至少两个可重复的连续K+-在开始实验之前,使用PSS收缩来获得标准力轨迹,每次收缩之间休息10分钟。然后用1µM卡巴胆碱激活组织并再次放松,就像在K+-PSS收缩。随后的收缩均包括1µM酚妥拉明和普萘洛尔,分别阻断α和β肾上腺素能受体。在最后1µM CCh收缩和清洗后,用1µM PDBu激活组织以记录其机械反应。

力数据分析

来自力传感器的电压信号通过PowerLab 400或4 SP硬件(澳大利亚Castle Hill的AD仪器)进行数字化,在计算机屏幕上以10 Hz的力(g)的形式显示(Chart v3.6或4.0,AD仪器),并通过软件命令存储到硬盘上,以备日后分析。数字是用电子表格程序Excel 2000(微软,华盛顿州雷蒙德)得出的。

凝胶电泳和Western印迹

如前所述分析蛋白质表达[29]组织在0.125 M Tris、2%十二烷基硫酸钠(wt/vol)、20%甘油、0.1%溴酚蓝(wt/vol)和20 mM二硫苏糖醇中以50 mg/ml的浓度均质。蛋白质在低交联十二烷基硫酸钠凝胶上分解[30]如前所述进行免疫印迹[31]PKCα抗体在~76 kD时识别一个单一带或更常见的双链,而CPI-17抗体在~17 kD时则识别一个单带。这些大小与基于凝胶流动性的这些蛋白质的预期大小一致。为了确保蛋白质印迹的准确性,对胃底和胃窦样品进行了5倍肌动蛋白(考马斯蓝染色)、PKCα和CPI-17(蛋白质印迹)负荷范围(4–20µl)的负荷曲线。结果表明,这两种组织中的所有三种蛋白质在这个范围内呈线性关系(R2>所有结果为0.98,n = 3). 在western blot上定量PKCα和CPI-17蛋白表达,使用5-10µl的负荷量,该负荷量在线性范围内(n = 6).

统计

使用MINITAB(宾夕法尼亚州州立学院MINITAB Inc.)进行统计比较。采用单样本t检验检测静息状态下胃窦和胃底PKCα/CPI-17的分布(外周与总ROI的比值为0.5,表明平滑肌细胞(SMCs)呈“均匀”分布)。采用单因素方差分析测试具有不同刺激参数的两种组织的PKC/CPI-17分布差异。采用两个样本t检验检验PKCα或CPI-17在胃窦和胃底的表达水平差异的显著性。两个标准偏差(SDs)相等的双尾F检验确定,与vinculin与PKCα的比率SD相比,caveolin与PKC A的比率SD显著更低。在所有统计测试中,P<0.05的值都被认为是显著的。未对力数据进行统计测试图1代表了6种不同动物的类似数据。蛋白质印迹数据来自六只动物。PKCα分布数据是每只动物测量的30个细胞的平均值,并对5只动物进行了测试。CPI-17分布数据是每只动物测量的10个细胞的平均值,并对三只动物进行了测试。蛋白质共同定位数据基于至少3只动物的至少20个细胞的“n”。

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用KPSS、1µM CCh或1µM PDBu刺激胃窦(红色)和胃底(蓝色)产生的力(归一化为KPSS刺激的峰值力)。

刺激期间,胃窦的收缩反应没有维持,而胃底的收缩反应保持不变。PDBu在胃底产生缓慢收缩,约为KPSS峰值力的40%,但在胃窦几乎没有收缩。每次洗涤开始时,痕迹中的偏转来自于改变腔室中的溶液。这些是用于机械测量的6种不同动物中的1种的代表性痕迹。

结果

猪胃底是一种主要的强直性平滑肌组织,对刺激的反应是持续收缩,而胃窦是一种主要的阶段性平滑肌组织,对刺激的反应是短暂收缩(图1). 在组织中,这些反应可能是直接刺激平滑肌的结果,因为添加了1µM普萘洛尔(β激动剂阻滞剂)和酚妥拉明(α激动剂阻滞剂)来防止由于交感神经递质的潜在释放而引起的肾上腺素能受体的激活。常规使用PDBu刺激平滑肌,通过PKC激活引起平滑肌收缩[32],[33],[34]一µM PDBU会导致胃底条轻微缓慢收缩(约40%的K+刺激反应),而胃窦基本无反应(<5%K+刺激)(图1). 这两种组织对KPSS和CCh的持续和短暂反应的差异,以及对PDBu刺激是否存在收缩反应,可能是由于下游第二信使(PKCα和CPI-17)的表达和/或时空分布所致据称与PDBu刺激抑制MLCP有关。为了验证这一点,我们测量了PKCα和CPI-17在这些组织中的表达水平并确定了其时空分布。

图2显示胃窦和胃底CPI-17和PKCα表达的western blot结果。对组织进行处理,控制蛋白质浓度,并根据各自蛋白质信号的强度计算结果,并将其归一化为肌动蛋白表达(图2). 两种方法(仅显示标准化数据)均表明,CPI-17蛋白和PKCα蛋白的表达均无显著差异(分别为p>0.23和p>0.28,n = 6) 比较这两种SM组织时。使用一系列加载进行控制,以确认加载的线性范围,并且用于定量的样品在该范围内(未显示数据,见方法)。由于这两种组织中这两种蛋白的表达没有差异,我们接下来要确定它们的时空分布差异是否可以解释它们对PDBu刺激反应的差异。

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CPI-17和PKCα在胃底和胃窦的蛋白表达。

A: 每个样本的CPI-17(左)和PKC(右)在胃底和胃窦的表达以及肌动蛋白(考马斯蓝染色)表达的western blot结果如下所示。B: 凝胶/蛋白质印迹结果的定量数据。CPI-17(左)和PKCα(右)的表达水平无显著差异(p>0.23和p>0.28,n = 6) 在胃底和胃窦之间。

图3显示PKCα在胃底和胃窦纵、环层分布的免疫组织化学结果。在放松溶液中的静息条件下,当组织不产生力时,PKCα似乎唯一地优先分布在SMC的外围(图3–绿色,PSS)。用1μM CCh(3′)或1μM PDBu(10和30′)刺激组织不会改变PKCα的外周分布。使用质膜附近PKCα分布与细胞总PKCα的比值来量化在这些不同条件下该蛋白分布的可能变化。图4结果显示为细胞外周PKCα与细胞内总PKCα的比值(外周/(外周+胞浆),见方法)。比率为0.5表示蛋白质在整个细胞中的“均匀”分布。在所有检查条件下,PKCα比率(外周/总)在0.64–0.68之间。这些值显著大于0.5(p<0.05),表明PKCα主要位于细胞外周(在细胞内不是“均匀”分布的),并且在放松或刺激条件之间这种分布没有变化。

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在放松(PSS)或刺激(3′CCh或10&30′PDBu)处理下,猪胃底(左)和胃窦(右)纵、环层横切面上PKCα分布的共焦图像。

组织免疫反应PKCα(绿色),并复染丝状肌动蛋白(指骨样蛋白红)和细胞核(DAPI蓝)。在所有条件下,PKCα主要位于靠近质膜的细胞外围。比例尺−10µm。

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细胞外周PKCα(顶面)和CPI-17(底面)与胃窦和胃底环向和纵向层总蛋白(外周+细胞溶质)之比的定量结果。

胃窦和胃底松弛状态(PSS)下PKCα的比值均显著大于0.5,表明松弛状态下PKCα优先分布在质膜附近。这一比例在不同的刺激处理下没有显著变化,表明PKCα在细胞中始终保持主要的外周分布。(n) = 5). 松弛状态下(PSS)胃窦和胃底两层的CPI-17比率没有显著差异,均小于0.5,表明CPI-17在整个细胞中分布均匀。CCh刺激3分钟不会改变CPI-17的比率,但眼底环形层除外。CCh(30′)和PDBu(30′p<0.05,**p<0.01(n = 3).

因为PKCα被提议激活CPI-17,所以我们继续在类似条件下测定CPI-17在这些组织中的时空分布。图5显示CPI-17在胃底和胃窦纵、环层分布的免疫组织化学结果。在放松溶液中的休息条件下,当组织不产生力时,CPI-17似乎在SMC中扩散分布(图5–PSS,图S1). 用1µM CCh(30′)(但3′不是1µM CCh,数据未显示)或1µM-PDBu(30′(图5,图S2). 利用CPI-17在质膜附近的分布与总CPI-17(外周血+胞浆)的比值来量化在这些不同条件下该蛋白分布的可能变化。图4结果显示为外围设备与总CPI-17的比值。在所有检查的组织和条件中,CPI-17比率(外周/总)在0.49–0.67之间。放松状态下CPI-17的外周/总比值与0.5没有显著差异(平均值为0.49–0.5;P>0.19),表明CPI-17在这种状态下广泛分布于平滑肌细胞。在刺激3′/1µM CCh后,这不会改变,因为与放松条件相比,仍没有显著差异(平均值 = 0.53–0.55; P> 0.05),但眼底组织除外,CPI-17外周/总比值在3′端显著增大(P<0.05)(图4). 在30′的1µM CCh或1µM PDBu刺激下,所有组织和层的CPI-17分布显著大于0.5(平均值 = 0.62–0.67,P<0.01),表明CPI-17现在主要位于细胞外围(不再“均匀”分布于整个细胞),类似于PKCα的分布(图4).

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放松状态(PSS)或刺激状态(30′CCh或PDBu)下猪胃底(左)和胃窦(右)纵环层横截面CPI-17分布的共焦图像。

组织对CPI-17(绿色)和细胞核(DAPI-蓝色)进行免疫反应。在松弛状态(PSS)下,CPI-17在细胞内呈弥散分布。在CCh或PDBu刺激下,CPI-17主要位于质膜附近的外围。比例尺–10µm。

PKCα(在放松和刺激条件下)和CPI-17(用CCh或PDBu刺激30′后)在细胞外周的主要外周分布不均匀,但呈点状分布(图6). SMC质膜上也有解剖和功能上不同的粘附连接和小窝点状分布[26]为了确定PKCα和CPI-17在膜上的分布是否与粘附连接的点状模式相一致,我们用两种粘附连接相关蛋白(vinculin和talin)进行了双重标记。红色和绿色荧光团在膜上的交替分布模式表明,PKCα和CPI-17不与vinculin或talin共存(图6)表明在我们研究的条件下,PKCα和CPI-17与粘附结合复合体无关。因为小窝在外周膜与粘连连接处交替[26],PKCα和CPI-17可能与小窝共同定位。为了确定PKCα和CPI-17在膜上的点状分布是否与小窝的点状模式相一致,我们还用小窝蛋白对PKCα进行了双重标记。在松弛和活化条件下,PKCα和小窝蛋白共同定位在膜上,可以通过黄色/橙色荧光而不是明显的红色和绿色荧光的出现来观察到(图6). 两个标准差(SD)相等的双尾F检验确定,与长春花素与PKCα之比的SD相比,小窝蛋白与PKCα之比的SD显著较低(n = 20个细胞;p<0.05)。此外,组织激活后PKCα与CPI-17的双重标记也显示出显著的共定位(n = 20个细胞;这两种蛋白在质膜附近的表达(p<0.05)(图7). 这些数据表明,PKCα在任何时候都主要位于SMC质膜的小窝附近,并且在组织激活后,细胞溶质CPI-17的很大一部分转移到血浆的小窝,在那里与PKCα共同定位。

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放松状态(顶行)和PDBu(30′)刺激(下行)下猪眼底(上面板)的共焦图像。

PKCα(绿色)和vinculin(红色,左上)或talin(红色,右上)或CPI-17(绿色)的双重标记。Vinculin和talin是粘附连接相关蛋白,似乎与PKC和CPI-17交替分布,表明这些蛋白并非定位于质膜附近的相同区域。注意,并非所有PKCα或CPI-17都位于质膜附近。下面板-松弛(PSS–上排)和激活(PDBu–下排)猪胃窦组织与PKCα(左栏,绿色)和小凹蛋白(中栏,红色)反应,并与细胞核合并(右栏,PKCα–绿色;小凹蛋白–红色;DAPI–蓝色)。PKCα和小窝蛋白的共放大导致黄色/橙色荧光。比例尺 = 10微米。

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猪胃窦被PDBu激活,与PKCα(左栏,绿色)和CPI-17(中栏,红色)反应,并与细胞核合并(右栏,PKCα-绿色;CPI-17-红色;DAPI-蓝色)。

PKCα和CPI-17的共放大导致黄色/橙色荧光。比例尺 = 10微米。

讨论

平滑肌组织通常被描述为“强直性”(产生缓慢维持的等长收缩)或“阶段性”(生成快速短暂的等长缩)。SM的力产生和/或组织缩短被认为需要提高肌球蛋白轻链磷酸化、ATP消耗和跨桥循环。引起这两种收缩的可能机制是钙的差异2+致敏。2+平滑肌的致敏性被认为在很大程度上是由于MLCP的抑制与组织激活期间MLCK的激活同时或随后[15],[35].钙的主要途径之一2+致敏是通过G蛋白偶联受体(GPCR)/磷脂酶C(PLC)/二酰甘油(DAG)/PKC/CPI-17抑制MLCP。GPCR、PLC和DAG均位于质膜中。MLCP的位置不太确定,但在组织激活后的某个时间点,MLCP需要与MLC相关20在粗纤维的肌球蛋白分子上,以使该蛋白去磷酸化。因为据报道厚厚的丝状体分布在SMC细胞质中[36],[37],[38],[39],MLCP也需要在松弛过程中的某个时刻分布在细胞质中[40]如果MLCP位于胞浆内且靠近MLC20在收缩过程中,PKCα和CPI-17在抑制MLCP中发挥作用,那么在收缩过程的某个时间,至少CPI-17可能位于胞浆中。本研究结果表明,在松弛和活化条件下,PKCα优先定位在质膜附近,而CPI-17在活化条件下也优先定位在膜附近。因此,这些数据表明PKCα-CPI-17Ca的差异2+敏化途径不能解释胃底和胃窦的强直性和时相性SM收缩,需要进一步研究CPI-17的时空分布与组织激活如何调节MLCP导致Ca2+完整SM组织中SM收缩的致敏性。

虽然PDBu导致眼底缓慢收缩,约为KPSS诱导的峰值力的40%,但在PDBu刺激下,胃窦几乎没有收缩。由于胃底和胃窦分别代表两种基本类型的平滑肌,即张力肌和相肌,因此将产生力的差异归因于相肌和张力肌的不同特性似乎是合乎逻辑的。Woodsome等人[41]据报道,紧张性血管性SM中CPI-17的表达水平高于阶段性血管性SM。这可以解释紧张性肌肉维持力量的不同能力(高浓度的CPI-17抑制MLCP,使MLC20磷酸化维持在较高水平,并强制维持在滋补SM中)。本研究检测了PKCα和CPI-17蛋白在猪内脏胃中的表达和分布。令我们惊讶的是,在胃底和胃窦之间,PKCα或CPI-17的蛋白表达水平没有显著差异(图2). 这些结果表明,强直平滑肌和时相平滑肌对不同刺激的反应差异不能仅用猪胃SM组织中PKCα或CPI-17蛋白表达的差异来解释。

PKC时空分布的研究仍然存在争议。几项研究表明,PKC作为一种移动的信使,将细胞激活信号从膜传递到胞浆。PKCα是一个大型丝氨酸/苏氨酸激酶家族的成员,于1977年由Nishizuka小组首次鉴定[42],[43]Castagna等人[34]谁是第一个报告促进肿瘤的佛波酯也可以直接激活钙2+活化的磷脂依赖性PKC标志着其在影响细胞功能方面的重要性和相关性。PKC细胞定位的第一份报告是在EL4小鼠胸腺瘤细胞中,据报道PKC活性在胞浆部分较高,但在佛波酯刺激后降低[44]随后对平滑肌进行的生化研究表明,PKCα在不同的时间和不同的时间段与不同的激动剂一起易位到膜[45],[46],[47].

免疫荧光显微镜可以直接观察细胞内潜在的PKC运动,显示PKCα在激动剂刺激孤立的单个平滑肌细胞后,经历了从胞浆到质膜的重新定位过程[48],[49],[50],[51],[52]与这些研究相反,也有证据表明PKC的运动方向相反。费伊小组[53]据报道,在分离的蟾蜍胃单个细胞中,在质膜附近发现了一个活化的PKC池。经CCh刺激后,活化的PKC(未提及特定亚型)从质膜相关池中释放出来,并在整个细胞液中重新分布。进一步研究表明,PKC在治疗后与收缩丝相关[53].

与多细胞制剂相比,消除分离/培养细胞中可能发生的潜在变化(细胞分离程序破坏细胞与细胞之间的联系,改变/去除细胞外基质,从而改变SM细胞骨架)[54],[55]本研究使用完整的组织来测定松弛和收缩过程中平滑肌细胞中PKCα的分布。令人惊讶的是,在放松状态下,PKCα在整个细胞中的分布并不“均匀”,在完整组织中的刺激也没有改变。在PDBu或CCh处理前后,PKCα主要分布在质膜附近(图3). 由于PKCα是一种相当大的蛋白质,在细胞内用作移动的第二信使可能效率不高。然而,CPI-17是PKCα下游的一种小的可溶性蛋白质,应该能够在SMC中自由扩散,直到PKCα被激活并与CPI-17结合。膜上PKCα与CPI-17的结合会改变质膜下区游离CPI-17浓度,导致更多CPI-17扩散到细胞外周,也可能与活化的PKCα结合。这样就不需要主动将CPI-17运输到外围,因为CPI-17的自由/结合浓度改变导致的简单质量扩散可以解释这种“移位”。我们的数据与此一致,表明CPI-17在松弛条件下在SMC中呈弥散分布,并且在组织激活后呈优先的外周分布(图4&5). CPI-17的这种易位发生在强直和相态胃底和胃窦,因此不能解释其收缩模式的差异。此外,CPI-17向膜显着移位所需的3-30分钟似乎太慢,无法解释在张力肌中观察到的早期张力。然而,这并不排除这种途径参与长期维持张力的可能性。

目前尚不清楚是什么使PKCα优先位于质膜上。DAG是膜结合的,在激活PKCα的同时,可以在细胞膜上与PKCα连接。然而,在本研究中观察到的静息状态下,PKCα在细胞外周的积累提出了一个问题,即当[DAG]被认为较低时,PKC的主要外周分布。由于没有证据支持PKCα是一种膜包埋蛋白,因此有必要推测其他膜相关蛋白在放松条件下与PKCα结合,以防止其在整个细胞中随机扩散。一些蛋白质被认为具有在细胞膜附近保持PKCα的能力。据报道,在培养细胞中,PKCα也可以在局部接触结构中检测到,并可能与talin或vinculin结合[56]在我们的研究中,用talin或talin在完整猪胃组织中对PKCα进行双重标记,显示PKCα优先靠近质膜,但与vinculin或talin呈交替点状模式(图6)表明PKCα与粘附分子连接无关。

其他几项研究表明,PKCα可能是一种被称为小窝的膜结构中的常驻蛋白[57],[58],[59],[60]研究已经确定多种小窝相关蛋白具有与PKCα结合的潜力。例如,一种名为血清剥夺反应(sdr)的68kD PKCα结合蛋白定位于小窝中[59]据报道,PKCα在催化结构域中有一个特殊的氨基酸序列(522WAYGVLLY528),该序列有可能与小窝蛋白Caveolin-1的支架结构域相互作用[61]。这一观察也得到了以下方面的支持体外实验表明小窝蛋白-1对PKCα有抑制作用。蔗糖梯度离心显示Caveolin-1和PKCα在同一组分中积累,这可能表明这两种蛋白之间存在键合[62].

一些被称为非活性/活性C激酶同工酶受体(RICK和RACK)的膜受体也被认为能够与失活或活化的PKC相互作用[21],[22],[63]它们的功能是将PKC维持在细胞膜上或附近的不同位置。据报道,其中一种支架蛋白AKAP150能够将PKC靶向独特的质膜结构域,其中L型钙2+通道已定位。PKC与Ca的接触2+建议需要通道来生成本构钙2+流入,流入[64]这与观察到的L型钙2+通道定位于心室肌细胞的小窝,因为PKC也被预测位于相同的位置[65]据报道毒蕈碱性平滑肌[66]提出PKCα由小窝蛋白或小窝相关蛋白锚定在细胞膜上并被DAG激活似乎是合乎逻辑的。我们的数据显示PKCα与小窝蛋白在小窝共同定位(图6)和vinculin/talin交替点状图案,与这个想法一致。

CPI-17在组织激活后的主要外周分布可以通过其与外周定位活化的PKCα结合来解释。Sakai等人研究了乙酰胆碱(ACh)刺激下大鼠支气管平滑肌中CPI-17的时空调节[67]。他们的免疫印迹实验显示,CPI-17在刺激后从细胞溶质部分向膜部分发生时间依赖性转移,磷酸化的CPI-17仅在膜部分发现,表明CPI-17是在质膜处被激活的[67].

我们的研究还揭示了刺激后CPI-17在膜上的点状分布(图7). 目前尚不清楚CPI-17在膜上的确切联系,但CPI-17确实与PKCα在小窝共同定位。这似乎是合乎逻辑的,因为如果PKCα要磷酸化CPI-17,那么PKC和CPI-17在某些时候需要相互关联。当CPI-17被观察到在刺激时从细胞溶质转移到细胞膜(图4&5)组织激活后,胞浆中仍有大量CPI-17残留(图4&5[68]). Kolosova等人。[68]据报道,CPI-17在人肺动脉内皮细胞中的分布与肌动蛋白平行,表明CPI-17和肌动蛋白共存。因此,当CPI-17位于胞浆中时,它可能与肌动蛋白丝相关,尽管我们在组织中没有发现这方面的证据。此外,据报道,一定量的CPI-17位于细胞核附近[69]PKCα可以定位于血管平滑肌细胞的核周区域的报道可能解释了这一点[70].

我们的数据表明,CPI-17向细胞膜的移位是一个非常缓慢的过程,需要3分钟以上的时间才能实现显著的移位(图4)CCh或PDBu刺激30分钟后,其仍优先位于质膜附近。Sakai等人[67]据报道,CPI-17在ACh刺激后需要2分钟才能转移到大鼠支气管SM的膜部分,并且只要组织受到刺激(>20分钟),它就会一直存在。他们还报告了磷酸化CPI-17的存在遵循稍慢的时间框架,在10分钟时在膜部分变得显著。在胞质部分中未观察到磷酸化的CPI-17,并且仅在组织松弛后浓度降低。因此,我们的数据(图4)以及来自[67]表明CPI-17(p-CPI-17)在组织被激活时不会返回胞质溶胶(Sakai的胞质部分)。

CPI-17(p-CPI-17,[67])在SM组织激活期间返回胞浆,在PKC/CPI-17/MLCP途径中留下钙的缺口2+MLCP失活致敏。而CPI-17(p-CPI-17,参考[67])主要位于平滑肌组织激活后的质膜附近[67]MLC20作为粗纤维肌球蛋白的一部分分布在整个细胞中。如果MLCP将去磷酸化MLC,那么它需要与肌球蛋白相关20,如果它将被抑制去磷酸化MLC,则需要与CPI-17相关20。有许多可能的解释可以解决这一问题。首先,该途径中还有另一种目前尚未确认的蛋白质,由CPI-17激活,并负责抑制MLCP。根据显示CPI-17对MLCP有直接抑制作用的出版物,这似乎不太可能[71]第二种可能是CPI-17不参与钙2+在完整的内脏SM组织中致敏,或者在特定的SM组织(胃和支气管)中可能不致敏。这似乎同样不太可能,因为有报道称该途径与肠道和气道相关[17],[67]第三种可能的解释是,在CPI-17分布发生变化后,MLCP实际上通过质量作用转移到外围。它可以被CPI-17在外围灭活,或者仅仅作为MLC不再有效20磷酸酶,因为它不再与MLC相关20位于胞浆中的粗纤维[40],[72]最后的解释似乎值得进一步测试。

这导致我们提出以下Ca模型2+通过PKC/CPI-17/MLCP途径致敏。在完整的内脏(和其他?)平滑肌组织中,PKCα主要通过与RICKs结合定位于质膜[21]随着组织激活,质膜DAG的增加激活了膜上的PKCα。CPI-17与活化膜结合的PKCα结合,导致其分布从扩散分布于整个细胞溶质转变为主要分布于质膜。活化的PKCα激活结合的CPI-17(p-CPI-17),该CPI-17留在细胞膜上,直到激活的刺激物被清除,组织松弛。MLCP是如何被抑制的,以及它是否在细胞内移动仍然没有解决。我们假设p-CPI-17在质膜上与MLCP结合。这将产生两个后果。首先,MLCP的分布将从胞浆转移到质膜(我们无法对此进行测试,因为无法获得在猪组织中起作用的MLCP抗体)。第二个后果是通过改变MLCP的分布,使其远离肌球蛋白(MLC)20)对于质膜,MLCP对MLC的去磷酸化无效20这可以解释Ca2+保持MLC敏化20磷酸化水平升高,并在组织受到刺激的延长时间内增强组织力。

一个尚未解决的问题是,强直性眼底和相态窦对PDBu刺激的不同反应。一种可能性是,对PDBu的不同反应是由基础钙的差异引起的2+强直性肌和阶段性平滑肌之间的水平。据报道,滋补组织中的[Ca水平较高2+]而不是放松状态下的相组织[73]虽然PDBu给药可能会增加Ca2+相平滑肌的敏化程度与强直组织相似,即[Ca的低基础水平2+]可能仍然无法维持相组织的强烈收缩。两种组织中肌浆网分布的差异可能是[Ca2+]在基本条件下[74]第二种可能是MLCP在强直平滑肌和相平滑肌中的表达模式不同,这种差异导致对PDBu刺激的收缩差异。相态平滑肌比强直组织含有更多MLCP的观察结果支持了这一点[41]上述解释并不一定是相互排斥的,主音和相位SM之间力产生差异的原因可能是两者的结合,需要进一步研究来解决这些问题。此外,据报道还有许多其他第二信使途径影响MLCP活性,包括RhoA/ROCK、ILK和Zip激酶,[18]这些无疑也很重要,需要测试。虽然整个机制仍未解决,但本研究表明,PKCα和CPI-17蛋白的表达或分布没有差异,这可以解释在完整的胃底和胃窦平滑肌中观察到的持续紧张性和短暂性相收缩。

支持信息

图S1

放松状态下猪胃窦圆形层横截面CPI-17分布的典型共焦Z叠加序列(PSS)。组织进行CPI-17免疫反应(绿色)。CPI-17在松弛条件下,无论Z堆叠段的水平如何,都会在整个单元中扩散分布。

(畅通节能法)

图S2

猪胃窦圆形层横切面CPI-17分布的典型共焦Z叠加序列,1 µM PBDu。组织进行CPI-17免疫反应(绿色)。在PDBu刺激下,CPI-17主要位于靠近质膜的外围,而与Z堆叠段的水平无关。

(畅通节能法)

致谢

作者感谢来自威斯康星州弗兰克斯维尔哈里·汉森肉类服务公司慷慨捐赠的猪组织样本。

资金筹措表

这项工作得到了国家科学基金会(NSF)、马奎特大学生物科学系和研究生院的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

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文章来自PLOS ONE系列由以下人员提供多环芳烃