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美国生理学杂志心脏循环生理学。2013年1月15日；304（2）：H269–H281。
2012年11月2日在线发布。 数字对象标识：10.1152/ajpheart.00158.2012
预防性维修识别码：项目经理3543664
PMID：23125215

MAP激酶激酶-2（MEKK2）调节缺氧性肺动脉高压右心室肥厚性重塑

R.戴尔·布朗,通讯作者1 S.Kelly Ambler,2 李敏（音）,1 蒂莫西·沙利文,2 劳伦·亨利,1 小约瑟夫·克罗斯诺。,2 卡林·S·朗,2 蒂莫西·加林顿,1和库尔特·斯坦马克1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

肺动脉高压（PH）导致心脏右心室（RV）压力过载，引发病理性RV重塑，最终导致右心衰竭。大量研究表明，通过MAPK超家族的信号传导介导病理性心脏重塑。这些考虑使我们测试了调节蛋白MAPKKK-2（MEKK2）参与低氧诱导PH中RV肥大的假设−/−小鼠）和年龄匹配的野生型（WT）小鼠暴露于慢性低压缺氧（10%O26周），并与常压下的动物进行比较。WT和MEKK2慢性缺氧诱导的PH值暴露−/−老鼠。对于PH，WT小鼠表现出RV肥大，表现为RV重量与体重的比率增加，舒张时RV壁厚增加，与正常氧合对照动物相比心肌细胞增大。相反，慢性缺氧后WT小鼠RV肥大的这些测量值在MEKK2中都有所减弱−/−老鼠。此外，慢性缺氧导致WT小鼠肥大和炎症基因表达的改变，与病理性RV重塑一致；与WT小鼠相比，MEKK2缺失选择性抑制炎症基因表达。MEKK2的作用部分通过调节其效应物ERK5的丰度和磷酸化来介导。总之，MEKK2的信号转导有助于RV肥大和改变心肌炎症基因的表达，以应对低氧诱导的PH。针对MEKK1的治疗可能保护人类PH心肌免受肥大和病理重塑。

关键词：心脏重塑、炎症、心肌细胞、缺氧、肺动脉高压、丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶-2、ERK5

右心室（RV）肥大（RVH）是对临床上重要的儿童和成人肺部疾病引起的肺动脉高压（PH）的反应(1). 这些肺部病理学起源于缺氧性肺环境，反映了缺氧性血管收缩和病理性血管重塑的自我永存过程，从而导致压力超载和随后的RV失代偿和衰竭。虽然肺血管病理学显然是疾病的始发机制，但心脏疾病的后果最终支配着临床结果(10,14,27).

PH中控制RVH和心肌重塑的机制尚不清楚，也没有针对心脏的治疗方法。新的证据表明，右心室在功能、解剖和生化方面与更多研究的左心室（LV）不同(58). 我们小组的合作研究显示RV肌原纤维Ca发生了变化2+低氧诱导PH的敏感性和蛋白磷酸化与压力超负荷LV的早期发现不同(59).

涉及心脏主要细胞系统的过程应被视为这些发现的潜在机制。弗斯特,心肌细胞肥大伴随着心肌细胞基因表达的特征性特征，是血流动力学负荷增加的直接结果。尽管历史上认为心脏肥大是代偿性的，但对心血管疾病或损伤的反应是持续病理学的指标(34,52). 心脏保护治疗，包括β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂、心脏再同步化和左心室辅助装置，可导致系统性心力衰竭肥大和病理基因表达的逆转重塑(16,40). 伊洛前列素血管扩张剂治疗降低实验性PH大鼠RV压力过载的类似结果已被报道(50). 其次，浸润免疫细胞和常驻心脏细胞的炎症和纤维化激活被认为是各种疾病状态下病理性心肌重塑的主要决定因素。大量研究证明低氧诱导的实验性肺动脉高压中肺血管的炎症重塑(39,44,55). 炎症性纤维化心脏重塑被认为是系统性硬皮病伴间质性肺病患者PH进展预后恶化的基础(37).

上述对肥厚心肌宏观重塑的描述激发了对调节心肌细胞表型的细胞内信号事件的深入研究。在这方面，人们关注的焦点是MAPK超家族作为心脏肥厚刺激的重要介质(60). 典型MAPK信号通过相关蛋白亚型的三个激酶级联介导，从上游MAPKKK（MEKK）开始，依次通向MEK和效应MAPK。MAPK通路与细胞对环境刺激的广泛反应有关(18,31). 广泛的研究记录了ERK、JNK和p38 MAPK在心脏重塑的特定方面的作用(42,47,57,60).

尽管做出了这些努力，但病理性心脏重塑和衰竭的机制尚不完全清楚。特别是，PH中RV功能障碍进展所特有的重塑过程才刚刚开始探索。最近的研究表明，由MEKK2启动的新MAPK通路对心肌肥厚、肺发育和炎症反应有促进作用，为研究MEKK1作为PH关键介质的作用提供了动力(23). MEKK2整合了来自不同刺激的输入，包括生长因子和物理化学应激源。在免疫炎症细胞中，MEKK2与T细胞受体在抗原提呈细胞激活T细胞中起伙伴作用(49)，在肥大细胞中介导高亲和力FcεRI受体的激活以产生炎性细胞因子(62)以及清道夫巨噬细胞对氧化低密度脂蛋白胆固醇的反应(45). MEKK2也参与大鼠皮层神经元的生存反应(61)成骨细胞的存活和分化(64)以及成纤维细胞对碱性FGF或IL-1的反应产生细胞因子(21,28).

MEKK2通过MEK5/ERK5和MEK7/JNK蛋白激酶协同激活信号(20). 尽管JNK MAPK接收来自各种上游调节器的输入（见上文），MEKK5/ERK5通路被MEKK2及其同源物MEKK3选择性激活。值得注意的是，ERK5参与了许多对PH反应很重要的过程，包括缺氧信号、炎症、血管生成和心肌肥大，详情如下。ERK5是发育中胚胎心脏形态发育、血管生成、血管-心脏相互作用和肺泡重塑所必需的，因此MEK5或ERK5缺陷的转基因小鼠无法存活(23,31,53). 主要缺陷似乎是由于在血管发育过程中需要ERK5作为内皮细胞中VEGF的负调节因子，以使血管成熟和稳定(48). ERK5还参与肺Kruppel-like因子2的产生，以响应层流剪切应力，后者是血管内稳态的重要转录因子(30). 另一方面，ERK5作为VEGF下游信号转导的阳性介质，拮抗血小板反应蛋白-1的抗血管生成作用，促进内皮细胞迁移和肿瘤血管生成(12,22). 因此，ERK5调节新生血管和血管稳态的多个方面。ERK5还介导EGF下游或ErbB受体的神经调节蛋白活化，并可能参与肺表面活性物质的产生和胎肺成熟(43). ERK5调节许多低氧反应和低氧诱导因子反应基因，并可能通过低氧诱导因素-1α刺激自身磷酸化和激活(31,51,53). 在心脏中，MEK5和ERK5的激活突变体在体外导致心肌细胞肥大和离心肥大，继而导致扩张型心肌病和体内猝死(41). 据报道，大鼠长期间歇性低氧暴露后心脏MEK5和ERK5的激活(9).

这些观察结果表明，MEKK2及其下游效应器参与了许多可能对PH心肌重塑至关重要的过程。然而，MEK02通路在低氧诱导的RV重塑中的作用尚未被探讨。此外，大多数研究都集中于MEK5和ERK5效应激酶，而不是上游启动子MEKK2，它接收来自各种受体和物理化学刺激的输入，并协调多种反应的激活，从而为治疗干预提供了重要的节点。因此，本研究验证了MEKK2调节PH中RV重塑的假设。为此，在慢性缺氧诱导PH的实验模型中使用了一种新的MEKK_2基因全局敲除转基因小鼠株。根据心肌细胞肥大和炎症重塑的定量参数，对MEKK2介导的PH患者RV重塑进行综合评估。该方法为针对人类PH中MEKK2的治疗提供了潜在益处。

材料和方法

实验协议。

实验动物的所有程序都是在科罗拉多丹佛大学（科罗拉多州奥罗拉）动物护理和使用委员会的监督下，根据批准的方案进行的。

转基因小鼠。

靶向破坏MEKK2的转基因小鼠−/−小鼠）通过将新霉素抗性基因插入MEKK2编码序列，如前所述生成(17). 尽管与野生型（WT）小鼠相比，观察到产仔数减少，但该转基因菌株作为纯合敲除小鼠成功繁殖。使用带有完整MEKK2基因的菌株匹配Sv129Im/J小鼠（WT小鼠）作为对照。给小鼠提供水，并以每天14小时光照到10小时黑暗的周期随意进食。使用以下引物对口腔拭子进行PCR分析，以验证WT MEKK2基因或插入的新霉素耐药基因的基因型：MEK02，正向5′-ATGCTCATCAATAGTA-3′和反向5′-AtgCGTACTCAAGCAT-3′；和新霉素抗性，正向5′-AATCGGCTGCTCTGATGCCGC-3′和反向5′-AAGGCATGCTGCGAATCG-3′。

暴露于慢性缺氧。

实验使用雄性小鼠（研究开始时为12-18周龄）。小鼠在配备持续低压缺氧（0.5 atm，Po（o）2：10%，相当于～5380m海拔）。每周将房间通风至室内空气，以进行笼子维护。年龄匹配的对照小鼠被安置在室内环境中（科罗拉多州丹佛市）。在研究期间未观察到小鼠的发病率或死亡率。在这些条件下，实验组之间的体重没有显著差异（体重：WT常氧，31.4±4.4 g；WT缺氧，26.9±3.4 g；MEKK2−/−常氧，29.1±4.4克；和MEKK2−/−低氧，28.6±6.7g；n个=7只小鼠/组）。

超声心动图。

在Colorado-Denver大学小动物血流动力学和成像设备上，在Vevo 770高分辨率超声成像系统上进行了超声心动图检查，该系统配有35MHz探头，专门用于小鼠超声心动图(2). 用1–1.5%异氟醚对小鼠进行轻微镇静，使心率保持在500次/min以上。实验组的心率如下：WT正常，509±37次/min；WT缺氧，544±30次/分；MEKK2公司−/−常氧，558±63次/分，MEKK2−/−低氧，542±21次/分[全部P（P）=不显著（NS）]。

在研究期结束时，通过将异氟醚雾化在正常呼吸空气或与10%O混合的呼吸空气中，在适当的缺氧或常氧条件下获得超声心动图2分别是。在获得标准超声心动图之前，对胸部进行脱毛。在乳头肌水平采集二维引导M型图像，以测量左室舒张末期和收缩末期的尺寸以及游离壁、前壁、隔壁和后壁的厚度。利用改良胸骨旁长轴视图进行RV测量[RV游离壁厚度、RV缩短分数和肺动脉（PA）血流]。获得了通过PA和三尖瓣的血流脉冲多普勒测量值，作为RV功能和肺血流动力学状态的进一步指标。所有测量均在呼吸周期的呼气相进行。这些回波测量用于计算左室和右室尺寸、心功能（缩短分数和心输出量）和肺血流动力学。

RV压力测定。

RV压力测量基本上如前所述(13,35). 简单地说，用氯胺酮-甲苯噻嗪对小鼠进行深度麻醉。RV通过一根充液导管直接插入导管，该导管与连接到专用计算机的压力传感器接口。对10个连续压力波形的序列进行分析和平均，以确定右室收缩压。

组织收获。

用三溴乙醇对动物进行深度麻醉。通过心脏穿刺或腹部切口和下腔静脉插管获取血液。为了进行RNA测定，切除心脏，切除心房和血管，将心脏浸入心脏停搏液中，并解剖成RV游离壁、LV游离壁和隔膜。在一些实验中，这些成分被吸干并称重。组织块要么在−80°C下储存在RNAlate中用于RNA分离，要么在液氮中快速冷冻并在−80C下储存用于免疫印迹分析。对于组织化学，完整切除心脏，并通过主动脉逆行灌注心脏停搏液，使心脏静止，然后在PBS中加入4%的多聚甲醛。对于肺的免疫组织化学分析，通过RV原位用PBS冲洗循环，并将肺固定在PBS的4%多聚甲醛中。将组织石蜡包埋并切成5μm的切片。

平滑肌α-肌动蛋白的免疫组织化学。

用平滑肌α-肌动蛋白抗体对肺切片进行免疫组织化学染色，定量肺微血管对缺氧的反应。将福尔马林固定切片和石蜡包埋切片在分级乙醇溶液中脱蜡，并在压力锅中与柠檬酸钠缓冲液（pH 5.5）孵育，以揭开抗原。用小鼠抗人平滑肌α-肌动蛋白一级抗体（克隆1A4，DAKO，1:50）进行免疫染色，然后用过氧化物酶偶联的马抗小鼠IgG（Vector Labs，1:200）进行免疫染色，并用二氨基联苯胺稀释剂（Vector Labs）开发。通过在尼康显微镜上对相同遮蔽样品进行目视检查，对直径小于450μm的外周肺血管进行评分。至少计数2个视野/肺叶（放大倍率：×10），4个肺叶/动物。该程序是在我们之前的研究中确定的(11).

肌细胞大小的测定。

如上所述将组织切片脱蜡，并用FITC-结合的小麦胚芽凝集素（Sigma）染色(19). 用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）观察细胞核。荧光图像记录在Leitz Axiovert显微镜上，该显微镜配有集成的电荷耦合设备摄像头和专用个人计算机上的图像处理软件。追踪肌细胞周长，计算至少20个有核细胞/显微镜视野、3-5个视野/实验动物的横截面积。

心脏基因表达分析。

根据制造商的规范，使用TRIzol试剂（Invitrogen）分别从6-7只动物/实验组的指定心脏区域分离出总RNA。使用Superscript II逆转录酶和随机六聚体引物进行第一链cDNA合成(25). 使用SYBR绿色超模（Bio-Rad）对iCycler MyiQ进行实时PCR，以量化目标基因的表达。探针丰度是相对于看家基因次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶丰度测定的(15). 本研究中使用的基因特异性引物序列如所示表1.

表1。

实时PCR的小鼠引物序列

基因接入号码正向底漆反向底漆
α-肌球蛋白重链我的6178885′-GGGCAGCTCATGCGCATTGA公司-3′5′-TGCGCTCTTCAGCAGCGGTT公司-3′
β-肌球蛋白重链我的71407815′-CAGCAGTTGGATGACT公司-3′5′-GATGCGTGCCTGAAGCTCCT-3′
骨骼肌α-肌动蛋白行动1114595′-AATGCTTCTAGGCGCACTCG公司-3′5′-CCTGCAACACAGACGATT公司-3′
Sarco（内质网）Ca2+-ATP酶2附件2a2119385′-TGTGAAGCTGTGCCGGCAAG-3′5′-AATGCGGCGACAGATGCCA公司-3′
心房利钠肽Nppa公司2308995′-CTGAGAGACGGCAGTGCTCT公司-3′5′-ATCCTACCCCGAGAGCT公司-3′
脑钠肽无购买力平价181585′-TTCGGTCTCAAGGCAGCACC公司-3′5′-ACAGCCAAACTGAGG公司-3′
IL-1β伊尔1b161765′-TGCCTTCCCCAGGGCATGTT公司-3′5′-海关总署-3′
S100A4型S100a4号机组201985′-GCTGCATTCCAGAAGGTGAT公司-3′5′-TGCAGGACAGAGACACAG公司-3′
单核细胞趋化蛋白-1Ccl2公司202965′-CACCAGCACCACACTCT公司-3′5′-ATGCTCCAGCGCACTGACTGT公司-3′
基质细胞衍生因子-1Cxcl12号机组203155′-ATCGGTGGCTGGAGCTGAA-3′5′-ACATGCCCTGGGATGTGCGT公司-3′
C-X-C趋化因子受体4型Cxcr4号机组127675′-AAGGGCCACCAGAAGCGCAA-3′5′-TGGCAGCCAGCAGGCAAAGA-3′
白介素-6伊尔6161935′-CCGGAGGACTTCACAG公司-3′5′-TCCACGATTTCCCAGAAC公司-3′
次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶Hprt（小时）154525′-TGGGCTTACCTCACTGTT公司-3′5′-CTAATCACGACGCTGGGACT公司-3′

免疫印迹分析。

将RV组织浸入并快速匀浆（Fisher PowerGen 125）于含有蛋白酶抑制剂（P8340，Sigma）和磷酸酶抑制剂（P5726和P0044 Sigma）的0.5ml RIPA缓冲液[150mM NaCl，50mM Tris·HCl（pH 8），2mM EDTA，1%（wt/vol）Nonidet P-40（Igepal CA630，Sigma），0.5%（wt/vol）脱氧胆酸钠和0.1%（wt/vol）SDS]中，各为1%（vol/vol）。将匀浆在10000℃下离心10分钟克温度为4°C。收集上清液进行免疫印迹分析。蛋白质浓度通过BCA分析（Pierce）测定。

免疫印迹程序基本上如前所述进行(38). 将组织裂解物（30μg/泳道）与6×莱姆利样品缓冲液混合，在预制SDS梯度凝胶（8-15%，Bio-Rad）上电泳，并电泳转移到硝化纤维膜上。用磷酸-ERK5（44612G，Invitrogen）、ERK5（3372S，Cell Signaling Technology）或MEKK3（ab33918，Abcam）抗体检测膜。使用抗β-肌动蛋白（A5441，Sigma）验证车道之间的等效样本荷载。使用的其他抗体如前所述(38). 用辣根过氧化物酶结合的二级抗体和增强的化学发光来制备印迹，通过放射自显影术进行可视化，并通过成像密度测定法（Bio-Rad）进行定量。

统计。

对每个实验组4至7只动物的四个单独队列进行了体内慢性缺氧或常压缺氧暴露。实验测定是从一个或多个这样的队列中报告的。数据以平均值±SE的形式报告。成对统计差异通过非成对双尾模型进行评估t吨-测试。采用单因素方差分析和Bonferonni的事后检验进行多组比较。P（P）用<0.05的值确定统计学意义。

结果

慢性缺氧导致WT和MEKK2 PH后遗症−/−129SvIm/J小鼠。

实验动物长期暴露于低压低氧环境下会引发一系列生理反应，包括PH的发展，并提供了一个已建立的模型，该模型概括了人类临床疾病的重要特征(8,56). 肺血管阻力和血压升高最初是由反射性血管收缩引起的，随后肺血管的内侧平滑肌肥大进一步加剧。净红细胞生成也可用于补偿缺氧和低氧血症，并可能部分导致PH。WT和MEKK2对缺氧的反应相似−/−鼠标，如所示图1。结果如所示图1A类证明肺动脉压（通过心导管测量的右心室收缩压）在WT和基因敲除小鼠中均升高。中显示的数据图1B类证明WT和MEKK2−/−小鼠对慢性缺氧进行红细胞生成反应，以红细胞压积进行测量。这一结果通过血清血红蛋白浓度的测量得到证实（数据未显示）。在小鼠中，内侧重塑被视为实质微血管的新肌肉化，平滑肌α-肌动蛋白的免疫染色。图1C类显示了典型的免疫组织化学图像，以及图1D类显示了累积定量，提供了证据证明暴露于缺氧的WT小鼠肌肉化血管的预测增加。MEKK2公司−/−小鼠表现出肌动蛋白阳性血管的显著增加，尽管与WT小鼠相比，这种反应减弱。

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慢性缺氧小鼠的肺动脉高压（PH）参数。实验动物暴露于慢性缺氧或正常大气中，如材料和方法进行端点测量。A类：右心室（RV）收缩压。右心室收缩压通过直接心导管测量，如材料和方法.n个=常氧组11-13只动物，缺氧组7-8只动物。B类：红细胞生成。红细胞压积按材料和方法.n个=11-12只正常氧组动物和4-5只缺氧组动物。C类肺实质血管肌化的免疫组织化学染色。肺组织进行平滑肌α-肌动蛋白（SMA）免疫染色，如材料和方法箭头表示肺实质中的免疫反应微血管（直径≤50-μm）。比例尺=100μm。MEKK2公司−/−，MEKK2击倒（KO）。D类：肺实质新生肌肉化的定量。SMA-免疫活性血管如图所示C类按中所述确定材料和方法.n个=7只动物/组*P（P）<0.05应变匹配的低氧与常压动物+P（P）WT和MEKK2之间的等效实验处理<0.05−/−菌株。

这些结果表明，MEKK2破坏小鼠对低压缺氧的反应与WT小鼠相似，可预测PH、肺血管重塑和造血的后果。

PH诱导的RVH在MEKK2中减弱−/−老鼠。

PH引起的右心室压力超负荷使一系列复杂事件发生运动，统称为心肌重塑。重要的是，RVH反映了RV壁厚和质量的增加，以补偿升高的壁应力。因此，在暴露于慢性缺氧或常氧的动物中，比较RV质量相对于（LV+隔膜）总和的比率，或RV重量相对于总体重的比率，以量化WT和MEKK2中的选择性RVH−/−老鼠。如预测所示，结果如下图2A类证明WT小鼠表现出相对于（LV+隔膜）RV质量的选择性增加。相反，在MEKK2中RVH变钝−/−小鼠的RV-to-（LV+隔膜）质量比与正常对照小鼠没有显著差异。补充分析如所示图2B类显示了长期缺氧动物的RV或LV质量与体重的比值。低氧暴露后，与MEKK2相比，WT小鼠的RV体重比显著增加−/−小鼠，而LV与体重的比率对于两种菌株是相等的。这些数据表明，WT小鼠在慢性缺氧后经历了显著的宏观RVH，而MEKK2破坏减弱了这种反应。

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右心室肥大的解剖学测量。实验动物暴露于慢性缺氧或正常大气中。对心脏进行解剖，获得心脏的指示重量和总体重，如材料和方法。显示了统计比较。A类：RV与[左心室（LV）+隔膜]的重量比。B类：RV和LV与体重（BW）的重量比。n个=4-5只动物/组。不另作说明，不重要。

右心室功能和形态测量的超声心动图分析。

超声心动图用于无创性评估MEKK2缺失对低氧诱导PH的RV形态计量学和体内表现的影响。结果显示图3缺氧诱导的PH的特征性超声心动图发现之一是高血压动物PA压力脉搏波的加速（缩短）和特征性E-a切迹的出现，如图3A类.图3B类显示了PH对PA压力波形的影响：峰值加速时间缩短，加速率增加，PA喷射时间缩短。在WT和MEKK2中，这些参数在预测方向上发生了显著变化−/−小鼠，与PH诱导的RV收缩压升高一致，如图图1.MEKK2中PA加速率适度降低−/−观察到小鼠对缺氧的反应。我们将这些参数之间的统计显著性差异归因于PA加速率作为PH临床指标的敏感性增强(4).图3C类显示了典型的心脏M型和B型超声心动图图像，说明了用于回波定量的形态参数。RV形态和功能的后续影响如所示图3D类PH增加了WT小鼠的RV壁厚，正如RVH的预期。MEKK2中也观察到壁厚增加−/−但与WT动物相比，效果显著降低。此外，超声心动图测量显示，与常氧相比，慢性缺氧暴露的WT小鼠的血管间隔厚度增加（0.98±0.06 vs.0.85±0.08 mm，P（P）<0.05），但不在MEKK2中−/−小鼠（0.79±0.14 vs.0.90±0.18 mm，P（P）=NS）。PH对任一菌株的LV壁厚均无影响（数据未显示）。此外，在WT和MEKK2慢性缺氧期间，RV功能（以RV缩短分数和心输出量测量）未发生改变−/−老鼠。我们注意到，实验组之间计算RV腔室缩短分数值所依据的腔室尺寸的成分值也没有变化（腔室尺寸：舒张期，WT正常氧1.25±0.18 mm，WT缺氧1.25±0.23 mm，MEKK2−/−常氧1.43±0.10 mm，和MEKK2−/−低氧1.23±0.27 mm，全部P（P）=NS；收缩压、WT常氧0.62±0.10 mm、WT缺氧0.71±0.15 mm、MEKK2−/−常氧0.71±0.16 mm，和MEKK2−/−缺氧0.75±0.24mm，全部P（P）=NS）。这些体内数据证实了MEKK2的结论−/−与WT动物相比，动物经历了类似的低氧诱导PH，但RVH减弱。

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RV功能和形态测定的回声心动图评估。对队列进行超声心动图分析(n个=7）每种实验条件下的动物。血液动力学和心功能参数以及形态测量如所述材料和方法.A类：肺动脉（PA）流出的超声心动图成像。WT正常的典型PA多普勒血流图像(左边)和缺氧(正确的)展示了动物。B类：PA血流动力学参数的量化。C类：右心室的超声心动图成像。典型的超声心动图M型(左边)和B模式(正确的)图中显示了用于测量RV形态和功能的解剖标志。RVIDd，舒张时RV内径（d）；收缩期RVID、RV间期直径。刻度单位为毫米。D类：心脏回波参数的量化*P（P）<0.05，应变匹配的低氧与常压动物+P（P）与WT和MEKK2相比，等效实验治疗<0.05−/−菌株。

PH诱导的心肌细胞肥大在MEKK2中减弱−/−老鼠。

上述RVH的解剖和形态计量学测量预计反映了心肌细胞水平上的净肌原纤维积聚和细胞大小增加。通过组织化学测量心肌细胞横截面积来验证这一假设，如图4用荧光结合小麦胚芽凝集素组织化学染色观察肌细胞周长，用DAPI观察细胞核。中显示的代表性图像图4与MEKK2相比，暴露于慢性缺氧的WT小鼠的心肌细胞大小增加−/−老鼠。通过计算机辅助形态测量法在含有已识别细胞核的细胞剖面中测定肌细胞横截面积，如图4B类这些综合数据表明，暴露于体内缺氧的WT小鼠RV心肌细胞大小显著增加，而MEKK2−/−小鼠低氧暴露后RV心肌细胞大小与正常对照小鼠无差异。综上所述，解剖、超声心动图和细胞形态计量学数据证实，MEKK2破坏可减弱PH引起的RVH。

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低氧诱导PH小鼠心肌细胞肥大。将小鼠暴露于慢性缺氧或正常大气中。对心脏进行处理，用荧光小麦胚芽凝集素染色，并按照材料和方法.A类：显示WT和MEKK2的RV游离壁中肌细胞轮廓的代表性图像−/−（KO）小鼠暴露于正常大气或慢性缺氧。B类：汇编的定量数据。n个=7只动物/组，每只动物60-100个心肌细胞。显示了统计比较。

PH诱导的肌细胞肥大基因表达。

除了细胞尺寸增加外，心肌细胞还通过关键基因产物表达的复杂变化来响应需求的改变。基因表达的特定模式似乎反映了输入刺激的性质（例如生理性与病理性），并为心肌细胞收缩性能的特定状态奠定了基础。值得注意的是，以前的研究已经确定了一组与病理性肥大相关的mRNA。这些基因包括从α-到β-肌球蛋白重链（MHC）异构体的异构体转换，子宫内正常表达的骨骼α-肌动蛋白的再表达，肌浆网钙的下调2+-ATP酶（SERCA）和心钠素（ANP）和脑钠肽（BNP）基因的上调。这种肥大基因程序已在啮齿动物的实验研究和人类心力衰竭的临床研究中得到验证(32,36,46). 因此，在我们的低氧诱导PH实验方案中，使用实时PCR分析研究了MEKK2破坏对心肌细胞肥大基因表达的影响，如图5这些数据表明，慢性低氧暴露于WT小鼠会导致病理性肥大基因程序的重要元素的重演，包括MHC亚型（α-MHC减少和β-MHC增加）之间的亚型转换，以及骨骼肌α-actin、ANP和BNP的表达增加。SERCA2的表达也降低，但没有达到统计学意义。MEKK2缺失适度增强了正常对照组的肥大基因表达（骨骼肌α-肌动蛋白和BNP增加）。慢性缺氧暴露进一步激活MEKK2中肥大基因的表达−/−与WT动物相比，MHC亚型转换的动物增加了胎儿骨骼肌α-肌动蛋白和利钠肽mRNA的表达，并下调了SERCA2的表达。这些结果表明，MEKK2独立于病理基因表达调节心肌细胞肥大生长。

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PH诱导的心肌细胞肥大基因mRNA表达。将动物暴露于慢性缺氧或正常大气中。肥大基因的RV表达分析如材料和方法.SERCA，肌（内质网）钙2+-ATP酶；心钠素；脑钠肽。n个=6–7只动物/实验组*P（P）<0.05，应变匹配的低氧与正常氧对照动物；†P（P）与WT和MEKK2相比，等效实验治疗<0.05−/−菌株。

MEKK2破坏可减弱PH诱导的炎症基因表达。

动物模型和人类患者的调查结果一致强调了炎症在肺血管和心脏对PH反应中的重要性(6,54). 此外，上述研究指出了MEKK2信号在低氧和炎症刺激反应中的潜在作用（见引言）。因此，研究MEKK2破坏对低氧诱导PH中RV炎症反应的影响非常重要。为此，使用实时PCR定量心脏炎症mRNA的表达。先前研究表明，在低氧诱导的PH期间，选定用于研究的细胞因子靶点在新生小牛肺血管重塑中增加(7)高血压动物血管外膜成纤维细胞(33). 数据如所示图6在WT小鼠中，慢性缺氧强烈诱导RV中重要促炎mRNA的表达，包括IL-1β、S100A4、单核细胞趋化蛋白（MCP）-1、基质细胞衍生因子（SDF）-1和C-X-C趋化因子受体4型（CXCR-4）。相反，MEKK2中每种mRNA的低氧诱导表达均减少−/−老鼠。在WT和MEKK2中，IL-6随着缺氧暴露而增加−/−菌株，但没有达到统计学显著性。这些结果清楚地表明，MEKK2的破坏减弱了RV炎症激活，同时降低了RVH，以应对低氧诱导的PH。

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PH诱导的炎症基因mRNA的表达。动物暴露于慢性缺氧或正常大气中。炎症基因的RV表达分析如材料和方法MCP、单核细胞趋化蛋白、SDF、基质细胞衍生因子；CXCR，C-X-C趋化因子受体。n个=4-7只动物/实验组*P（P）<0.05，菌株匹配的低氧对照动物与常氧对照动物；†P（P）与等效实验治疗相比，WT和MEKK2之间的差异<0.05−/−菌株。

MEKK2调节高血压RV中的MAPK信号。

为了确定RVH中MEKK2信号的机制，通过免疫印迹分析评估了下游MAPK靶点的磷酸化和丰度。首先，结果如图7A类证明慢性低氧和常压缺氧对WT小鼠的MEKK2丰度没有影响，正如预期的那样，MEKK_2破坏的小鼠中没有MEKK2-丰度。此外，我们发现相关蛋白MEKK3在WT和MEKK2的RV中表达−/−常氧和慢性缺氧下的动物诱导的PH。如图7B类WT正常小鼠的RV表现出组成性ERK5磷酸化。5周低氧暴露导致ERK5磷酸化维持，ERK5总丰度增加。相比之下，正常血压MEKK2的RV−/−小鼠表现出ERK5丰度和磷酸化的下调。慢性低氧暴露导致ERK5丰度上调，但与WT动物相比，敲除动物的ERK5磷酸化仍然减弱。另一方面，在这些实验条件下，JNK丰度和磷酸化对MEKK2破坏或慢性缺氧都不敏感，如图7B类。磷酸-ERK5和总ERK5密度测定结果如所示图7C类在单独的免疫印迹实验中，我们也观察到ERK1/2和p38 MAPK的丰度和磷酸化状态没有变化（数据未显示）。这些结果表明，首先，MEKK2信号在正常RV中被组成性激活，MEKK 2输入的丢失下调了靶ERK5的表达和磷酸化。其次，慢性低氧诱导的PH上调了RV中ERK5的表达和磷酸化。这种激活部分而不仅仅依赖于MEKK2的输入。这些结果表明MEKK2信号通路在RV内环境稳定和肥厚性重塑中的作用。最后，MEKK2似乎通过小鼠RV中的ERK5 MAPK选择性地发出信号。

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RV中MEKK和MAPK丰度和磷酸化的免疫印迹分析。用所示抗体对来自指定实验动物的RV组织匀浆进行免疫印迹，如材料和方法β-肌动蛋白的免疫印迹分析用于测量车道之间的等效蛋白质负荷。A类：MEKK2和MEKK3。请注意，MEKK3的车道名称与MEKK2的相同。B类：磷酸化（p）ERK5、ERK5，pJNK和JNK。C类：定量ERK5丰度和磷酸化状态。复制实验动物的免疫印迹通过成像密度测定法测定，如材料和方法.n个=4-6只动物/实验组*P（P）<0.05，应变匹配的低氧与正常氧对照动物；†P（P）与等效实验治疗相比，WT和MEKK2之间的差异<0.05−/−菌株。

讨论

实验动物的慢性低氧暴露会引起一系列解剖和血流动力学反应，导致PH重现人类疾病的重要方面。虽然这种重塑在小鼠中较为温和，但我们的数据清楚地表明了对慢性缺氧的预测反应，包括明显的PH、肺血管重塑和红细胞生成增加。此外，缺氧性PH导致的RV压力过载表现为RVH，并改变了肥厚和炎症基因表达的程序。我们的数据表明，在这个模型中，肥大是RV特有的，认为血流动力学压力超载是独立于LV也经历过的整体缺氧或红细胞增多症的必要条件。MEKK2基因敲除小鼠在缺氧环境下产生PH。然而，MEKK2的破坏导致RVH的显著和选择性衰减，并伴随着对PH的炎症基因表达减少。据我们所知，这是第一项将MEKK2确定为RV肥大重塑的重要调节因子的研究。

RVH是对PH引起的壁应力增加的反应。由于出生后动物的心肌细胞基本上不能增殖，壁厚的增加反映了由于额外肌节的有序沉积导致单个心肌细胞大小的物理性增加(3). 在这方面，我们还注意到慢性缺氧MEKK2−/−与WT小鼠相比，尽管缺氧导致右心室收缩压升高，但小鼠的肺微血管新生肌肉化程度降低。这一结果可能反映了MEKK2在血管肥大中的作用与在心肌肥大中观察到的作用类似。MEKK2公司−/−小鼠在低氧诱导的PH中PA加速率减弱，进一步表明MEKK2信号在肺血管的高血压重塑中起作用。

心肌细胞基因程序的改变在心脏损伤或疾病导致的病理性肥大中有很好的特征。这些变化反映了肌细胞向胎儿基因表达模式的逆转，包括β-MHC相对于α-MHC的表达升高，骨骼肌α-肌动蛋白的再表达，SERCA的表达减少，以及心室中ANP和BNP的再表达（成人的表达通常仅限于心房）。肌细胞整体重新编程可能通过降低心肌氧自由基发挥心脏保护作用2消耗，防止钙2+过载，并减少血浆容量(46). 在WT和MEKK2中观察到这些变化−/−慢性缺氧小鼠。因此，MEKK2缺失并不影响PH的发展，也不影响心肌细胞感知压力升高并对基因表达改变作出反应的能力，而是选择性地限制心肌细胞的肥大生长。先前在一项研究中观察到心肌细胞基因表达与肥厚生长之间的分离(24)其中Fos转录因子的显性负突变选择性地阻止了病理基因的表达，但在体外不阻止心肌细胞肥大。

我们进一步观察了缺氧诱导PH的WT小鼠中炎症基因的RV激活。这些结果强调了低氧诱导PH中肥厚性重塑和RV炎症激活之间的密切而复杂的关系。低氧或心脏损伤引起的炎症反应最初可能是一种适应性反应。然而，失调或过度炎症可能加剧病理性心脏重塑和功能障碍(26). 炎症细胞因子可直接作用于心肌细胞，引起收缩功能障碍，或重要的是，促进心肌细胞肥大(65). 也许我们研究中最引人注目的发现是，MEKK2破坏减弱了心肌细胞肥大和心肌炎性细胞因子mRNA的产生。被确定为MEKK2调节靶点的mRNA包括IL-1β，一种炎症激活的主要细胞因子；S100A4是晚期糖基化终产物信号转导受体的内源性配体，MCP-1是循环单核细胞募集和激活的关键细胞因子，趋化因子SDF-1及其同源受体CXCR-4也参与循环免疫和祖细胞的募集。值得注意的是，常驻心脏肥大细胞被认为是心脏细胞因子的重要来源，并在肥厚性重塑中发挥重要作用(5). 在这种情况下，MEKK2的炎症激活减弱−/−与先前报道的MEKK2-null肥大细胞激活缺陷的观察结果一致(62).

前一份报告(41)已证明ERK5（MEKK2的一个重要下游效应器）通过过表达活化的MEK5结构物在体内外控制心肌细胞肥大中发挥作用。我们扩展了这些发现，以表明MEKK2破坏减弱了ERK5的丰度和活化，这与观察到的体内PH对RVH的衰减一致。我们进一步观察到组成型ERK5的丰度和活性取决于MEKK2，这表明其在正常RV稳态中的作用未被重视。同时，应注意的是，慢性高血压在缺乏MEKK2的情况下上调ERK5的丰度和活化，提示了额外的代偿机制。在这方面，我们观察到RV中密切相关的MEKK3的表达，在没有MEKK2的情况下，可能部分提供功能冗余。最后，MEKK2似乎通过ERK5选择性地发出信号，而不是JNK、ERK1/2或p38 MAPK，在这些慢性压力过载的情况下。显然，我们的实验只检测了长期低氧诱导PH后的稳态激活，额外的MAPK也可能有助于RVH的启动。这些结果为进一步研究RVH中MEKK2-MEKK3和下游MAPK的协调信号机制提供了动力。

MEKK2的这些作用可以在肥厚性重塑和向RV衰竭过渡的背景下考虑。我们的结果表明，MEKK2对RVH和压力过载时伴随的炎症激活起重要作用。然而，超声心动图测定的右心室功能得以保留，这可能反映了小鼠心脏对该模型中中度PH值的补偿能力。在更严重的RV（或LV）损伤模型中测试MEKK2缺失的影响将是令人感兴趣的。我们预测，当RVH足以补偿所施加的心脏负荷时，MEKK2发挥有益的适应性作用，而过度的MEKK1活性将在向失代偿性RV衰竭过渡的过程中产生不利影响。最近的一项研究表明，MEKK2-ERK5信号在适应性心肌肥厚中的有益作用与过度刺激下的不利作用之间的平衡(29)左室压力超负荷模型显示心肌特异性ERK5缺失可阻止代偿性左室肥厚，但同时增加心肌细胞凋亡；相反，Nicol等人的报告(41)表明突变的MEK5对ERK5的构成性激活增加了心肌细胞肥大和心脏性猝死。因此，预计减弱MEKK2的治疗对严重PH导致的失代偿性RV衰竭具有选择性益处。

这些结果为进一步研究指明了方向。这一具有全局MEKK2破坏的体内模型提供了一个关于MEKK_2在心肺重塑中作用的综合视角。明确MEKK2在肺血管系统和RV中的作用对于将我们的研究成果转化为有效的治疗方法至关重要。在RV重塑的背景下，在体外研究MEKK2缺失对心肌细胞和成纤维细胞表型的影响将非常重要。此外，对MEKK2细胞内信号，尤其是与心肌重塑相关的信号的理解尚处于早期阶段。包括Lad、14-3-3蛋白和热休克蛋白90在内的细胞内伙伴蛋白已在其他模型系统中鉴定，ERK5和JNK MAPK被确定为重要的下游效应器(63). 然而，MAPKKK的一个决定性特征是他们能够响应和整合各种刺激。MEKK2对机械拉伸或缺氧作出反应从而导致协调性心肌肥大和炎症的具体机制尚待确定。本研究中开发的方法学和概念框架可用于未来评估靶向MEKK2信号的治疗药物在PH和RV衰竭的发展和进展中的作用。

赠款

这项工作得到了儿童医院研究所研究学者奖（授予R.D.Brown）和国立卫生研究院CA-85276（授予T.P.Garrington）、HL-59428（授予C.s.Long）以及HL-14985和HL-81506（授予K.R.Stenmark）的支持。

披露

作者未声明任何利益冲突，无论是财务上的还是其他方面的。

作者贡献

作者贡献：R.D.B.、C.S.L.和T.P.G.研究的概念和设计；R.D.B.、S.K.A.、M.L.、T.M.S.、L.N.H.和T.P.G.进行了实验；R.D.B.、S.K.A.、M.L.、T.M.S.、L.N.H.和T.P.G.分析数据；R.D.B.、S.K.A.、C.S.L.、T.P.G.和K.R.S.解释了实验结果；R.D.B.、S.K.A.和L.N.H.编制的数字；R.D.B.起草的手稿；R.D.B.、S.K.A.、J.T.C.J.、C.S.L.、T.P.G.和K.R.S.编辑和修订的手稿；R.D.B.、S.K.A.、M.L.、T.M.S.、L.N.H.、J.T.C.J.、C.S.L.、T.P.G.和K.R.S.批准了手稿的最终版本。

致谢

作者感谢Gayle Jones在RNA分离和分析方面的帮助，以及Cara Rada在心肌细胞大小测定方面的帮助。

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文章来自美国生理学杂志-心脏和循环生理学由以下人员提供美国生理学会