跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
前神经电路。2009; 3: 2.
2009年5月27日在线发布。2009年4月20日在线预发布。 数字对象标识：10.3389/神经系统.04.002.2009
预防性维修识别码：PMC2691658型
采购管理信息：19506708

谷氨酸RuBi：神经元和树突棘的双光子和可见光激活

埃洛迪·菲诺,1 罗伯特·阿拉亚,1 达西·彼得卡,1 马塞洛·萨利埃诺,2 罗伯托·埃切尼克,2和尤斯蒂先生1,*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

我们描述了RuBi-Glutamate的神经生物学应用，这是一种基于钌光化学的新型笼状谷氨酸化合物。RuBi-Glutamate可以用可见波长激发，并在单光子或双光子激发后释放谷氨酸。它具有高量子效率，可以在低浓度下使用，在一定程度上避免了与其他笼状化合物一起存在的GABA能量传输的阻断。RuBi-Glutamate的双光子非鞘化具有较高的空间分辨率，并通过生理动力学在单个树突棘中产生兴奋性反应。通过激光束多路复用，双光子RuBi-Glutamate uncasing也可以用于去极化和激发单细胞分辨率的锥体神经元。因此，RuBi-Glutamate能够用可见或双光子光源对神经元树突和电路进行光激活，从而实现单细胞甚至单棘的精确性。

关键词：去壳、钌、联吡啶、RuBi-GABA

介绍

笼状化合物在神经科学中得到了广泛的应用，因为它们能够对神经元电路进行光学操作（Hess，1999). 使用谷氨酸和GABA等光释放神经递质，可以激活或抑制神经元过程、单个神经元或神经元群（Ellis-Davies，2005). 将其与功能成像相结合，提供了一种近乎理想的监测和控制神经元活动的方法，从而为神经回路分析提供了一个完全光学的方法（Nikolenko等人。，2007).

特别是，由于功能化硝基苯甲基衍生物（例如7-硝基吲哚基-和4-甲氧基-7-硝基吲哚基-氨基（MNI）谷氨酸盐）的相对较高的双光子吸收截面，谷氨酸的双光子非壳化以其优异的空间分辨率非常有用（Canepari等人。，2001; 松崎等人。，2001). 例如，MNI-谷氨酸双光子去盖已成功用于功能性映射突触受体（Matsuzaki等人。，2001)，激活单个脊椎（Araya等人。，2006; 卡特和萨巴蒂尼，2004; 加斯帕里尼和马吉，2006; 松崎等人。，2004; Sobczyk等人。，2005)并激活单个神经元（Nikolenko等人。，2007). 尽管MNI-谷氨酸有用，但它需要以相对较高的浓度（mM）应用于组织，以实现有效的双光子去盖。不幸的是，在这些浓度下，MNI-谷氨酸和其他笼状化合物一样，是GABA能量传递的一种非常有效的拮抗剂（MNI谷氨酸见下文；Maier等人。，2005; 莫尔纳和纳德勒，2000对于其他化合物）。这对于它在神经回路研究中的应用可能是一个重大问题，因为它的应用可能导致癫痫样事件。此外，由于它强烈阻断GABA能反应，因此阻止了对抑制性网络活动或连接性的研究。

为了帮助避免这个问题，我们利用了钌化学的灵活性，并使用钌-联吡啶配合物合成了一系列新型笼状化合物（Zayat等人。，2003,2005). 钌是一种过渡金属，由于其化学性质的多样性而被广泛使用。钌光释整个配体的多吡啶通过一种广为人知的机制以异构化的方式进行光释，在这种机制中，初始光激发状态迅速演化为离解状态，因此光释是干净快速的（Zayat等人。，2003). 我们最近介绍了一种笼状GABA化合物（“RuBi-GABA”），可用于神经元的光学失活和GABA能电流的功能映射（Rial Verde等人。，2008). 现在，我们描述了一种新的笼状谷氨酸化合物“RuBi-glutamate”的生物学特性，它可以通过单光子或双光子激发进行光释放，并且比MNI-谷氨酸具有更少的非特异性效应。RuBi-Glutamate的化学合成和光化学特性在其他地方进行了描述（Salierno等人，提交）。虽然我们预计RuBi-Glutamate将有助于单光子可见非激活实验，但在本报告中，我们主要关注其在双光子光刺激中的应用，因为已经有几种合适的选择可用于谷氨酸单光子非激活的神经元光刺激（Callaway和Katz，1993; Callaway和Yuste，2002; Frick等人。，2001; 佩蒂特等人。，1997; Shepherd等人。，2003; Wieboldt等人。，1994; Yoshimura等人。，2005).

材料和方法

切片制备和电生理

使用Leica VT1000-S振动棒和含有（mM）：27NaHCO的切削液，从14天龄C57BL/6小鼠皮层制备350μm厚的冠状切片三，1.5 NaH2人事军官4，222蔗糖，2.6 KCl，2 MgSO4，2氯化钙2.切片在32°C的ACSF中培养30分钟，然后在室温下保持至少30分钟，再转移到记录室。记录室在ACSF（pH 7.4）中浸泡，也保持在室温下，并用95%的O饱和2和5%CO2，含（mM）：126 NaCl，3 KCl，2 MgSO4，2氯化钙2，1 NaH2人事军官4，26氯化钠三和10葡萄糖。

当记录抑制和兴奋事件时，神经元要么保持在静息膜电位（−65 mV），要么保持在+40 mV。使用全细胞电极（4-7 MΩ）。为了建立全细胞访问，在显微镜视场光阑上用斜光和IR通滤波器照射细胞，并通过连接到Sony PVM-137黑白视频监视器的CCD相机（DAGE-MTI IR-1000）进行可视化。除图中所示以外的所有录制​图22和​和3三采用细胞内溶液（pH 7.25）进行试验，其中含有（mM）：135 K-甲基硫酸盐、10 KCl、10 HEPES、5 NaCl、2.5 Mg-ATP、0.3 Na-GTP和0.1 Alexa Fluor 594。图中所示的电压钳记录​图22和​和3三用细胞内溶液（pH 7.25）进行，含有（mM）：128 Cs-甲磺酸、10 HEPES、2 MgCl2，2 MgSO4,4钠2-ATP，0.4 Na-GTP，10 Na2-磷酸肌酸和0.1 Alexa Fluor 594。实验在室温（22-25°C）下进行。我们使用MultiClamp 700B（分子器件）放大器从2/3层和5层锥体细胞进行记录，并使用LABView或Matlab开发的自定义软件通过National Instruments PCI 6259板获取信号。在一组实验中，使用放置在第5层中的双极电极进行电刺激。以0.2 Hz的频率重复刺激。记录IPSC时常规使用CNQX（20μM）和APV（40μM），并在ACSF中添加TTX（2μM）以分离微型突触电流。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为fncir-03-002-g002.jpg

谷氨酸RuBi对自发突触电流的影响.（A）RuBi-Glutamate对保持膜电位为-65时记录的自发活动的影响 mV。在此静息电位下，RuBi-Glutamate（300 μM）对自发性PSCs的平均振幅、频率或上升时间没有显著影响(n个 = 6个神经元）或在TTX存在下记录的微型PSC(n个 = 6个神经元）。（B） RuBi-Glutamate对自发活动的影响 +40 mV.鲁比-谷氨酸盐（300 μM）倾向于降低自发和小型PSC的振幅和频率，但只有小型PSC频率的降低具有统计学意义(第页 < 0.001,n个 = 6个神经元）。事件的上升时间没有变化。因为兴奋和抑制事件都记录在 +40 mV，这表明RuBi-Glutamate可能对IPSC有抑制作用。误差条代表SEM***第页 < 0.001.

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为fncir-03-002-g003.jpg

谷氨酸RuBi和谷氨酸MNI对抑制传递的影响.（A）锥体神经元对细胞外电刺激的电压钳反应。使用外部双极性刺激电极在+40时钳制神经元以激发反应 mV和APV（40 μM）和CNQX（20 μM）隔离GABA电流。这里我们展示了在控制条件下诱发的IPSC的例子，以及添加RuBi-Glutamate（300 μM，左侧）或MNI-谷氨酸盐（300 μM或2.5 mM，右侧）到浴缸。（B）显示在存在RuBi谷氨酸盐或MNI谷氨酸盐的情况下GABA电流抑制的平均值的直方图**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001.

使用Matlab、MiniAnalysis v6.0.7或IGOR Pro和Neuromatic v2.0软件包进行离线分析。为了在整个研究过程中保持一致，所有测量值均表示为平均值±SEM。使用Student’st吨-检验和非参数Mann–Whitney检验（如适用）在显著性水平上(第页)指示。

RuBi-谷氨酸开盖

使用基于Olympus FV-200系统的定制双光子激光扫描显微镜（侧装在BX50WI显微镜上，40×，0.8NA，浸水物镜）和钛宝石激光器（Chameleon Ultra II，相干，>3 W，140 fs脉冲，80 MHz重复率）采集图像。荧光是用光电倍增管（PMT:H7422-P40 Hamamatsu，Bridgewater，NJ，USA）检测的，该管连接到信号放大器（信号恢复AMETEK高级测量技术，英国沃金汉），其输出连接到Fluoview系统。首先，使用Fluoview软件（XY扫描模式，1×至10×数字变焦）在850 nm的波长下用最小功率采集躯体图像，以防止RuBi-Glutamate去细胞化。由于RuBi-Glutamate是光敏的，电脑屏幕和视频监视器上覆盖了两层Rosco#27中红色滤光片。

使用定制软件选择了一个体细胞非切割点（Nikolenko等人。，2007)，其触发了未计时脉冲并控制了脉冲持续时间。激光功率由Pockels电池进行调节（Quantum Technology，Lake Mary，FL，USA）。对于躯体刺激，每一个非衰老目标由八个子目标组成，每个子目标被照亮8次 ms，总持续时间为～70 ms。子目标本身很复杂，由五个非常紧密的光束组成，这些光束是通过将激光束与衍射光学元件（DOE）多路复用而产生的。每4次重复刺激 s.RuBi-Glutamate于300加入浴缸 μM浓度。双光子实验选择的浓度，300 μM是使用我们的刺激方案能够可靠点火的最低浓度。而我们用低浓度的RuBi-Glutamate（～150 μM），神经元不持续放电（有时甚至根本不放电）。单光子实验，用30个 μM的RuBi谷氨酸盐。

Dynamax蠕动泵（Ranin Instruments Inc.，Woburn，MA，USA）用于控制浴缸灌注，以最小化浴缸总容量和循环含氧介质。使用800进行开箱 nm光用于双光子实验，并且具有473 纳米光用于单光子实验。

为了测量单个脊椎的横向双光子非相干空间分辨率，将激光束放置在脊椎头部附近（～0.2 距脊柱头部边缘μm），然后从脊柱头部边缘移开。我们特别决定不直接在脊椎头部开盖谷氨酸盐，以避免损伤脊椎膜，我们知道直接激光照射可能会损害脊椎膜。相反，为了防止光损伤并在不影响脊柱头部的情况下触发可靠的谷氨酸反应，我们将光束指向下一个方向（～0.2 μm）。有了这个刺激方案，我们可以长时间可靠地对脊椎进行光刺激，而不会造成任何明显的光损伤。此外，为了测量RuBi-Glutamate非切割响应的轴向分辨率，将激光束放置在脊柱头部附近，并在不同焦平面（间隔0.8 微米）。在这些测试中，4 2毫秒激光脉冲 使用s间隔。为了记录第5层神经元的去同步自发微型兴奋性突触后电位（mEPSP），我们用锶（Xu-Friedman和Regehr，2000). 空间滤波混淆了mini-PSP（mPSP）或mini-PSC（mPSC）与光电响应之间的比较。mPSP或PSC分布广泛，部分原因是事件发生在许多不同的空间位置，每个位置对记录电极都有不同的电缆长度滤波，而在我们的光激发响应中，距离要均匀得多。

结果

鲁比谷氨酸双光子去壳激活谷氨酸受体

谷氨酸RuBi（顺式-[Ru（bpy）2（项目经理三)谷氨酸2]（PF6)2，使用bpy = 2,2′联吡啶和PMe三 = 三甲基膦）是一种笼状谷氨酸化合物，由具有六个配位位置的钌中心组成，其中四个配位位置被两个双齿二哌啶占据，第五个配位位置被三甲基膦占据，第六个配位位置被一个通过其氨基配位的L-谷氨酸分子占据（图​（图1A）。1A） ●●●●。在吸收一个可见光光子或两个近红外光子后，RuBi-Glutamate在纳秒内发生光裂解，并从Ru-bipyridine核心释放谷氨酸，在pH 7下量子产率为～0.13，消光系数为 >4,000 米−1 厘米−1在473 nm（Salierno等人提交）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为fncir-03-002-g001.jpg

RuBi-Glutamate去盖激活谷氨酸受体.（A）钌-联吡啶-三甲基膦-谷氨酸盐（RuBi-谷氨酸）的结构和谷氨酸的光释反应。（B）上面板：装有Alexa-594的2/3层锥体细胞，以及细胞体上多路非集总激光靶（八个子靶）的位置。下面板：2/3层锥体神经元中RuBi-Glutamate（300μM）的非激活触发的动作电位。在这个例子中，一个动作电位是用180 mW的通电样本诱发的，另两个动作电位则是用220 mW诱发的。（C）RuBi-Glutamate激活谷氨酸受体。添加APV（40μM）和CNQX（20μM）阻止了非屏蔽响应。（D）非屏蔽响应的代表性电流-电压图。注意在+10 mV时它是如何逆转的，这表明反应是由谷氨酸受体介导的。

我们首先通过对小鼠新皮层切片中2/3层锥体神经元进行全细胞记录，检测了RuBi谷氨酸盐激活谷氨酸受体的能力。用含有笼状RuBi-Glutamate的溶液对切片进行清洗，激光束对准记录的神经元的胞体，即去壳谷氨酸，同时记录激活神经元的膜电位，并监测去壳的效果。使用这种功能性分析来探测双光子非相干，我们探索了几种不同的激发波长和浓度，发现800个 nm为最佳值，300 μM足够的RuBi-Glutamate浓度，以产生可靠的功能反应。对于这里提到的单光子研究，我们使用了473 nm光和30 μM RuBi-Glutamate，尽管由于单光子激发的高吸收截面和较大的单光子点扩散函数（PSF），我们也能够产生浓度低至～5 μM（未显示数据）。这些波长和浓度与通过检查RuBi-Glutamate的光化学性质所预期的波长和浓度一致（Salierno等人，提交），并且与我们之前工作中使用的RuBi-cage化合物家族的其他成员相匹配，例如RuBi-GABA（Rial Verde等人。，2008).

在电流钳下记录的锥体神经元中，谷氨酸的双光子去极化产生短暂的去极化，但在单个激光点上，诱发的去极化太小，无法可靠地引起细胞激发动作电位。因此，我们使用DOE将激光束空间复用为五个紧密间隔的小光束，这是我们之前在MNI谷氨酸盐光刺激中引入的策略（Nikolenko等人。，2007). 然后将该波束阵定向到单元上的八个子目标上（图​（图1B，1B、 上部面板），释放更多谷氨酸，产生更强的细胞反应，导致动作电位。使用该协议，双光子非相干（平均约70 毫秒，150–400 样品上的mW；n个 = 15个神经元）能够可靠地产生动作电位（图​（图1B，1B、 下部面板）。非老化去极化幅度为1至20 mV，并通过谷氨酸受体拮抗剂APV/CNQX的浴敷有效且可逆地阻断（图​（图1C；1C类；40/20 μM；96.7 ± 电压降低1.5%，n个 = 6个神经元）。此外，在电压灯条件下，RuBi-Glutamate非屏蔽产生的内向电流在 +10 mV，表示谷氨酸受体电流（图​（图1D）。1D） ●●●●。这些数据证实，RuBi-Glutamate的去壳化激活了皮层锥体神经元中的谷氨酸受体。

鲁比-谷氨酸对自发PSC的影响

然后，我们对RuBi-Glutamate对突触受体的药理作用进行了表征。如前所述，在对双光子激发有用的浓度下，MNI-谷氨酸几乎完全阻断抑制性突触传递（参见下图​图3）三)防止其清洁用于电路研究。为了检测谷氨酸RuBi的影响，我们在沐浴应用谷氨酸RuBi之前和之后，对不同保持电位下的自发突触电流进行了电压钳记录。我们用300个 μM，RuBi-Glutamate的浓度与我们用于双光子非屏蔽的浓度相同。我们还进行了钠通道阻滞剂TTX存在和不存在的实验，以专门测试mPSC是否受到RuBi-Glutamate的特异性影响。

静息膜电位为-65 mV，镀液300 μM RuBi-Glutamate对TTX存在时自发PSCs或mPSCs的平均振幅、频率或上升时间无明显影响（图​（图2A，2A中，n个 = 来自六个控制神经元的1562个事件，在RuBi-Glutamate存在的情况下来自六个神经元的1775个事件）。自−65 mV大多数PSC是兴奋性的，这些数据表明浴用鲁比-谷氨酸对自发兴奋性PSC（EPSCs）没有显著影响。然后，我们通过在 +40 mV保持电位，兴奋性PSC和抑制性PSC均可轻易检测到的水平。在 +40 mV，镀液300 μM RuBi-Glutamate产生了降低自发和微型PSC振幅和频率的总体趋势，事件的上升时间没有明显变化（图​（图2B）。2B） ●●●●。尽管这些影响在统计学上并不显著，但在TTX存在的情况下，我们确实观察到PSC频率显著降低(第页 < 0.001,n个 = 6,t吨-测试）。这一结果，加上在−65时缺乏显著影响 mV与IPSC的逆转电位相近，表明RuBi-Glutamate笼式结构对抑制电流具有潜在的拮抗作用。

鲁比-谷氨酸对诱发抑制传递的影响

为了直接检查RuBi Glutamate是否对IPSCs具有拮抗作用，我们进行了一系列实验，通过用刺激电极刺激记录神经元周围的神经膜，同时将神经元保持在 +40 mV，在APV和CNQX在场的情况下（40/20 μM），因此在存在或不存在RuBi-Glutamate的情况下更好地隔离IPSC。这些实验的基本原理是测试RuBi-Glutamate是否阻断了生理突触GABA能的传递，因为我们的最终目的是使用RuBi-Gulatamate的双光子去电离进行电路研究。用MNI-谷氨酸盐进行侧面实验，以检查其对GABA能流的影响。我们测试了MNI-谷氨酸在300 μM，我们的RuBi-Glutamate未封存实验中使用的浓度，以及所需的较高浓度的MNI-谷氨酸盐（>2.5 根据我们的经验，用于有效的双光子MNI-谷氨酸开盖。

在这些实验中，灌注300μM RuBi-Glutamate使诱发的GABA能IPSC的峰值振幅显著降低（图​（图3：三: 50.0 ± 6.0%,n个=7个单元格，第页< 0.001). 以相同浓度（300μM）灌注MNI-谷氨酸，诱发的IPSC下降更为明显（图​（图3B；三B类；83.0 ± 3.0%,n个＝4，第页< 0.001). 在2.5 mM时，有效的双光子解封所需的浓度，MNI谷氨酸盐完全阻断了诱发反应（图​（图3：三: 97.0 ± 2.0%,n个= 6,第页< 0.001).

我们的结论是，尽管有300个 μM RuBi-Glutamate对内源性GABA能电流具有显著的拮抗作用，这种作用（接近50%）比MNI谷氨酸的作用（在300℃时为～80%）小 μM，～100%，有效浓度为2.5 mM）。在这些RuBi-Glutamate实验中观察到的50%减少与在 +40 TTX中自发微电位的mV记录（图​（图2）2)部分原因可能是 +40 mV-one记录了EPSC和IPSC的混合物。

RuBi-glutamate去盖能激活单个树突棘

然后，我们测试了RuBi-Glutamate的双光子去壳化用于激活树突棘，这是双光子谷氨酸去壳化最有用的应用之一（Araya等人。，2006; 卡特和萨巴蒂尼，2004; 加斯帕里尼和马吉，2006; 松崎等人。，2004; Sobczyk等人。，2005). 在这些实验中，我们对锥体神经元进行了全细胞记录，并用Alexa 594填充它们，以最佳地可视化它们的树突棘。然后我们用RuBi-Glutamate（300 μM），并将脉冲激光照射到所选脊椎附近的神经膜（图​（图4A、B）。4A、 B）。有4个 ms激光脉冲，我们在神经元中触发了可靠的去极化（参见图中的痕迹​图4C、D）。4C、 D）。这些反应的振幅与MNI-谷氨酸双光子去盖后记录的事件相似（见表​表1）。1). 然而，RuBi-Glutamate产生的神经元反应的上升速度几乎是未经处理的MNI-Glutamite产生的反应的两倍(第页 < 0.001,n个 = 65例RuBi-Glutamate四个脊椎的去壳事件与。n个 = 127个MNI-谷氨酸从九个脊椎中去壳事件）。此外，10–90%的上升时间和37%的衰减时间动力学比不加MNI-谷氨酸盐的情况下观察到的更快(第页 = 0.001和第页 < 分别为0.001，表​表1），1)，更接近自发mEPSP的动力学（表​（表1，1，请参阅材料和方法用于检测mEPSP）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为fncir-03-002-g004.jpg

RuBi-Glutamate去盖层对树突棘的光学激活.（A）装载Alexa-594的2/3层神经元检测树突棘。（B）选择用于开盖的树突棘的高分辨率图像。红色圆点表示未封存的位置。（C）从脊椎取下的XY空间分辨率图，如所示（B）（插图，记录道对应于不同位置[1–4的15个非屏蔽电位的平均值（B）].（D）开槽的空间轴向分辨率。来自受刺激脊椎的图像的Z堆栈。轨迹对应于其对应图像堆栈的15个非装箱电位的平均值。红点表示激光束驻留的位置，而不是光束轮廓的实际大小。（E）图中所示三个不同位置的轴向分辨率（D）.

表1

谷氨酸RuBi对自发突触电流的影响在所有四个变量中，MNI-谷氨酸与谷氨酸RuBi、谷氨酸MNI-与mEPSP、谷氨酸RuBi与mEPSPs的配对比较具有统计学意义第页 < 0.001. 以平均值表示的值 ± 扫描电镜。

振幅（mV）上升速率（mV/ms）10–90%上升时间（ms）衰减时间（ms）
RuBi–谷氨酸1.20 ± 0.09 (n个 = 65)0.092 ± 0.01 (n个 = 65)13.98 ± 1.13 (n个 = 65)23.11 ± 1.79 (n个 = 59)
MNI–谷氨酸0.92 ± 0.03 (n个 = 127)0.04 ± 0.002 (n个 = 127)19.08 ± 1.24(n个 = 127)53.43 ± 4.24 (n个 = 114)
高级2+–mEPSP0.55 ± 0.006 (n个 = 1,317)0.06 ± 0.001 (n个 = 1,316)8.20 ± 0.09 (n个 = 1316）16.06 ± 0.21 (n个 = 1,217)

在这些单脊椎实验中，我们还通过监测诱发去极化，同时改变激光相对于树突脊椎的位置，来探索非鞘化反应的空间分辨率。移动垂直于脊椎的未切槽点（即在XY平面中）导致未切槽响应的振幅大幅降低（使用光束1.3时降低了～80% 距离脊椎μm，图​图4C；4C类；n个 = 7个脊椎和2个神经元）。在轴向（Z）方向上，位置发生微小变化，0.8 μm，也导致电压响应显著降低（图​（图4D、E；4D、 E；平均减少71%；n个 = 30个非托管事件，n个 = 2个神经元）。这些结果与双光子PSF定义的小的局部非电离体积一致，并且与使用MNI-谷氨酸双光子非电离获得的测量结果类似（Araya等人。，2006). 因此，RuBi-Glutamate的双光子去盖具有近似于典型树突棘尺寸的空间分辨率，因此可用于选择性激活单个棘。

RuBi-glutamate去盖能激活单个神经元

最后，我们测试了RuBi-Glutamate在神经元光学光刺激中的潜在用途。在这些实验中，一个人打开谷氨酸的外壳，从期望的神经元靶点激发动作电位，对于绘制切片中的突触输入非常有用（Callaway和Katz，1993; Shepherd等人。，2003; Yoshimura等人。，2005). 此外，利用双光子激发，可以用单细胞精度构建这些输入映射（Nikolenko等人。，2007).

这些实验是通过用全细胞电极记录锥体神经元，并将非切割激光照射到细胞体上，在300片细胞中浸泡 μM RuBi-Glutamate（图​（图5A）。5A） ●●●●。如前所述，我们使用八个子目标和一个DOE对激光束进行空间复用（图​（图5B）。5B） ●●●●。根据该协议，我们在记录的神经元中可靠地产生了动作电位（90.0 ± 动作电位发生率为2.6%～70 毫秒无盖脉冲，n个 = 11个细胞；图​图55).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为fncir-03-002-g005.jpg

RuBi-Glutamate去盖对神经元的光学激活作用.（A）用Alexa-594填充2/3层锥体细胞。（B）未封存目标的位置（八个子目标）。当放在躯体上时，无盖会引发动作电位。当靶点移离体细胞时，去盖仅引起阈下去极化，没有反应10 μm外。（C）RuBi-Glutamate去盖的横向（XY平面）和轴向（Z平面）分辨率可引发阈上或阈下事件。请注意，当目标被放置10时，阈下去极化是如何强烈降低的 距胞体μmX（X）-轴和30 μm远Z轴-轴（上面板）。如果目标从2号体移走，则解开不会引发动作电位 μm远X（X）-轴和5 μm远Z轴-轴（下面板）。

我们通过将时空复用激光图案从细胞体中移开来表征我们的多点非缓存协议的有效空间分辨率（图​（图5B），5B） 测量阈下突触后去极化的幅度和阈上事件的概率，作为最近靶点到细胞边缘距离的函数。对于阈下事件，在XY平面上，我们测量到无盖反应的振幅强烈下降，在距躯体10μm处的最小反应（标准化振幅：0.10±0.01，n个=8个神经元；图​图5C）。5C） ●●●●。Z平面内的运动导致响应幅度的较小调制（标准化幅度：30μm时0.19±0.02，n个=5个神经元；图​图5C）。5C） ●●●●。由于多光束和目标模式在空间中分散，可以理解的是，阈下事件的空间分辨率低于单激光点的分辨率（图​（图4）。4). 然而，对于阈上事件，我们观察到诱发动作电位的发生率显著下降，因为在XY平面上，无盖靶点仅从躯体边缘移动2μm（动作电位发生率的3.0±2.8%，n个=7个神经元），Z平面胞体上方5μm（10.0±7.6%，n个=4个神经元；图​图5C）。5C） ●●●●。在这些实验中，我们避免了在任何突出的树枝状突起附近进行非时效处理。然而，当靶向躯体时，用于产生动作电位的相同刺激条件仅在有意（或无意）靶向树突时产生阈下反应。

我们还探索了在类似的实验中使用单光子RuBi谷氨酸解封，使用30μM RuBi谷氨酸和单个激光点，瞄准胞体中心。在1ms激光脉冲下，单光子RuBi-Glutamate去极化在细胞内产生可靠的去极化。该响应在XY和Z平面上的空间分辨率不同，在15（标准化振幅：0.14±0.03，n个=4个神经元）和40μm（归一化振幅：0.20±0.03，n个=3个神经元）。

这些实验表明，RuBi-Glutamate可以在单光子和双光子模式下对脑片中的神经元进行可靠的光刺激。特别是，双光子DOE非相干的空间分辨率似乎足以用于单细胞精度的研究。

讨论

在这里，我们介绍了RuBi-Glutamate作为一种新的化学工具用于光激活电路中的单个树突棘和皮层神经元。过去，谷氨酸开盖被成功用于绘制单光子激发电路图（Bureau等人。，2004; Callaway和Katz，1993; Shepherd等人。，2003; Yoshimura等人。，2005). MNI-谷氨酸的合成（Canepari等人。，2001; 松崎等人。，2001)实现了脊椎的双光子光激活（Araya等人。，2006; 松崎等人。，2004)和神经元（Nikolenko等人。，2007)尽管MNI-谷氨酸对突触受体的非特异性作用阻止了其用于抑制回路的双光子研究。

RuBi-Glutamate具有许多理想的特性，例如在可见光（蓝色）中具有相对较高的吸收截面和较高的量子效率（Salierno等人，提交）。这种组合使得RuBi-Glutamate的使用浓度低于MNI-谷氨酸盐，减少了对GABA能反应的阻断。与其他需要紫外线激发的笼状谷氨酸化合物相比，RuBi化合物吸收和释放可见光的能力也很显著，因为蓝光对活组织具有更高的穿透力和更低的毒性。虽然我们只是粗略地探讨了RuBi-Glutamate在单光子非相干中的应用，但我们应该指出，它具有一些有用的功能，其他用户可能会发现它可能对单光子实验感兴趣。具体来说，我们已经用来自各种光源的可见光有效地解开了谷氨酸盐的盖子，包括标准汞灯/氙气灯、LED光源，甚至激光指示器和手电筒，这使得谷氨酸盐解开实验所需的仪器非常容易获得，而且价格低廉。此外，也可以使用廉价的玻璃光学元件代替UV透明石英来开盖RuBi-Glutamate。

也许更重要的是，红移单光子光谱导致了红移双光子非相干峰（800 RuBi-Glutamate为纳米，MNI-Glutamete为725纳米）。除了深入组织外，800 nm接近双光子实验中常用的Ti-Sapphire激光器的最大功率输出峰值，这意味着可以在多个位置同时获得更多功率，这是未来探索复杂神经电路动力学实验的一个重要考虑因素（Nikolenko等人。，2008).

我们与RuBi-Glutamate的初步经验是积极的，我们报告了一些可以使其广泛应用的优势。它是水溶性的，在探索的有效单光子或双光子去壳浓度下没有任何强烈的药理作用。尽管浓度较高（300 μM）它显著降低GABA能反应，但不会阻止它们，因此可以绘制抑制回路，并在抑制仍部分参与的情况下刺激树突棘，从而进行更多的生理实验。这一点，再加上与硝基苄基和硝基吲哚基谷氨酸衍生物相比，RuBi-Glutamate去壳所需更长波长的光毒性降低和穿透深度增加，可能会使体内无套管实验可行。

利益冲突声明

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

致谢

我们感谢Alan Woodruff最初描述了MNI-谷氨酸对IPSC的影响，并感谢两个实验室的成员提供帮助和评论。由卡夫利脑科学研究所、国家眼科研究所、富布赖特委员会、CONICET、ANPCyT、哥伦比亚大学科技创业办公室和“康复医学基金会”（FRM）提供支持。

工具书类

  • Araya R.、Jiang J.、Eisenthal K.B.、Yuste R.（2006）。脊柱颈部滤过膜电位.程序。国家。阿卡德。科学。美国。 103，17961–17966 10.1073/第0608755103页[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • 第一局，Shepherd G.M.，Svoboda K.（2004）。大脑皮层功能和解剖柱的精确发育.神经元 42，789–801 10.1016/j.neuron.2004.05.002[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Callaway E.M.，Katz L.C.（1993年）。笼状谷氨酸的光刺激揭示了活体脑片中的功能电路.程序。国家。阿卡德。科学。美国。 90，7661–7665 10.1073/pnas.90.16.7661[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Callaway E.M.，Yuste R.（2002年）。用光刺激神经元.货币。操作。神经生物学。 12，587–592 10.1016/S0959-4388（02）00364-1[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Canepari M.、Nelson L.、Papageorgiou G.、Corrie J.、Ogden D.（2001）。7-硝基吲哚啉基和4-甲氧基-7-硝基吲哚啉基氨基酸作为新型快速笼状神经递质的光化学和药理学评价.《神经科学杂志》。方法 1122016年10月29日至42日/S0165-0270（01）00451-4[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Carter A.G.、Sabatini B.L.（2004年）。纹状体中棘神经元树突状棘的状态依赖性钙信号.神经元 44，483–493 10.1016/j.neuron.2004.10.013[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Ellis-Davies G.C.（2005）。光活化基础.英寸神经科学与发展成像：实验室手册，Yuste R.，Konnerth A.eds（纽约冷泉港，冷泉港出版社；），第367–373页[谷歌学者]
  • Frick A.、Zieglgèansberger W.、Dodt H.U.（2001年）。谷氨酸受体在新皮质锥体神经元顶树突上形成热点.《神经生理学杂志》。 86，1412–1421[公共医学][谷歌学者]
  • Gasparini S.、Magee J.（2006年）。海马CA1锥体神经元的状态依赖性树突计算.《神经科学杂志》。 26，2088–2100 10.1523/JNEUROSCI.4428-05.2006[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Hess G.P.（1999）。笼状神经递质的设计与应用.英寸成像：实验室手册，Yuste R.，Lanni F.，Konnerth A.eds（冷泉港，冷泉港出版社；），第25.21–18页[谷歌学者]
  • Maier W.、Corrie J.E.、Papageorgiou G.、Laube B.、Grewer C.（2005）。笼状配体对NMDA受体抑制作用的比较分析.《神经科学杂志》。方法 1422016年10月1日至9日/j.jnumeth.2004.07.006[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Matsuzaki M.、Ellis-Davies G.C.、Nemoto T.、Miyashita Y.、Iino M.、Kasai H.（2001）。树突状棘的几何形状对海马CA1锥体神经元AMPA受体的表达至关重要.自然神经科学。 4，1086–1092 10.1038/nn736[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Matsuzaki M.、Honkura N.、Ellis-Davies G.C.、Kasai H.（2004）。单个树突棘长期增强的结构基础.自然 429，761–766 10.1038/nature02617[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Molnar P.、Nadler J.V.（2000年）。γ-氨基丁酸、α-羧基-2-硝基苄基酯选择性阻断大鼠齿状回抑制性突触传递.欧洲药理学杂志。 391，255–262 10.1016/S0014-2999（00）00106-0[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Nikolenko V.、Poskanzer K.E.、Yuste R.（2007年）。神经回路的双光子光刺激和成像.自然方法 4，943–950 10.1038/nmeth1105[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Nikolenko V.、Watson B.O.、Araya R.、Woodruff A.、Peterka D.S.、Yuste R.（2008）。SLM显微镜：使用空间光调制器的无扫描双光子成像和光刺激.前面。神经系统。电路2–5, 1–14[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Pettit D.L.、Wang S.S.、Gee K.R.、Augustine G.J.（1997年）。化学双光子uncaging：一种新的谷氨酸受体定位方法.神经元 19，465–471 10.1016/S0896-6273（00）80361-X[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Rial Verde E.M.、Zayat L.、Etchenique R.、Yuste R.（2008）。利用无机笼基在可见光下释放GABA.前面。神经系统。电路 2, 2. 10.3389/神经.3304.3002.3200。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Salierno M.、Marceca E.、Peterka D.S.、Yuste R.、Etchenique R.（2009）。基于钌-多吡啶复合物的快速可见笼状谷氨酸.（已提交）。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Shepherd G.M.、Pologruto T.A.、Svoboda K.（2003）。发育中大鼠桶状皮层经验依赖性可塑性的回路分析.神经元 38，277–289 10.1016/S0896-6273（03）00152-1[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Sobczyk A.、Scheuss V.和Svoboda K.（2005年）。单个海马树突棘中NMDA受体亚单位依赖的[Ca2+]信号.《神经科学杂志》。 25，6037–6046 10.1523/JNEUROSCI.1221-05.2005[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Wieboldt R.、Gee K.R.、Niu L.、Ramesh D.、Carpenter B.K.、Hess G.P.（1994年）。谷氨酸的光敏前体：微秒级谷氨酸受体的合成、光化学特性和活化.程序。国家。阿卡德。科学。美国。 91，8752–8756 10.1073/pnas.91.19.8752[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Xu-Friedman M.A.，Regehr W.G.（2000）。探索锶突触传递的基本方面.临床杂志。神经科学。 20, 4414–4422[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Yoshimura Y.、Dantzker J.L.、Callaway E.M.（2005）。兴奋性皮层神经元形成精细的功能网络.自然 433，868–873 10.1038/nature03252[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Zayat L.、Baraldo L.、Etchenique R.（2005）。实用指南：可见光开盖，无机笼状化合物.英寸神经科学与发展中的成像：实验室手册，Yuste R.，Konnerth A.eds（纽约冷泉港，冷泉港出版社；），第391–394页[谷歌学者]
  • Zayat L.、Calero C.、Albowers P.、Baraldo L.、Etchenique R.（2003）。神经化学光传递的新策略：金属-异构化裂解.美国化学杂志。Soc公司。 125，882–883 10.1021/ja0278943[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
文章来自神经电路的前沿由以下人员提供Frontiers Media SA公司