摩尔粘度。2009; 15: 737–746.
2009年4月13日在线发布。
视网膜缺血再灌注后猪视网膜动脉和视网膜神经中的蛋白激酶C
,1 ,1 ,2 ,1和
1 1瑞典隆德大学眼科
2瑞典隆德大学医学系
通讯作者。 通信对象：Malin Malmsjö，瑞典隆德大学血管研究所，BMC A13，SE-221 84隆德；电话：+46 733 565650；传真：+46 46 222 0616；电子邮件：malin.malmsjo@med.luse 收稿日期：2008年7月14日；2009年4月7日验收。
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摘要
目的
视网膜缺血时激活的细胞内信号转导通路的识别对于揭示新的药理靶点可能很重要。迄今为止，大多数研究都集中于识别神经保护剂。视网膜血管是循环衰竭的关键器官，因此本研究旨在分别检查视网膜血管和神经视网膜。
方法
通过提高猪眼内压诱导视网膜缺血，然后再灌注5、12或20小时。蛋白激酶C（PKC）α、PKCβ1和PKCβ2 mRNA水平以及蛋白表达采用实时PCR、western blot和免疫荧光染色技术进行测定。
结果
在这个猪模型中，视网膜动脉可以很容易地从神经视网膜中分离出来进行研究。这个PKCα,PKCβ1、和PKCβ2在视网膜动脉和神经视网膜中，缺血再灌注组的mRNA水平往往低于假手术组。这在5小时后最为明显，在再灌注12小时和20小时后不太明显。同样，缺血再灌注后PKCα、PKCβ1和PKCβ2的蛋白水平与假手术眼相比略低。在神经视网膜的双极细胞和内皮细胞中观察到PKCα、PKCβ1和PKCβ2免疫染色，在视网膜动脉的平滑肌层中观察到少量PKCβ。
结论
视网膜缺血再灌注导致神经视网膜和视网膜动脉中PKC水平降低。通过研究视网膜血管系统，可以找到药物治疗的新靶点，从而确定视网膜循环衰竭后损伤发展中涉及的细胞内信号转导途径。
介绍
糖尿病、静脉血栓形成和动脉闭塞引起的局部循环衰竭导致的视网膜缺血是导致视力危险并发症和失明的主要原因[1]. 在视网膜缺血时，会形成新的血管来满足缺血组织的代谢需求。新形成的血管发生故障，无法补充必要的营养物质。它们会泄漏和出血，因此不再是血脑屏障的一部分。这会导致视力受损的并发症，如牵引性视网膜脱离、玻璃体出血、新生血管性青光眼和黄斑水肿[1–3]. 视网膜缺血用激光光凝治疗，这对保存视力是有效的，但以牺牲视网膜的大部分及其感光细胞为代价。尽管已经进行了许多旨在限制缺血后视网膜损伤程度的研究，但仍没有有效的药物治疗方法[2,4].
大多数研究都集中于确定治疗视网膜缺血再灌注损伤的神经保护剂[1]. 视网膜的血管是局部循环衰竭的关键器官，因此不仅要检查神经视网膜，而且还要检查视网膜血管系统。为此，我们建立并评估了一种压力诱导视网膜缺血的猪模型，在该模型中，视网膜动脉可以与神经视网膜分开进行研究。猪眼以前已经被证明适合视网膜动脉的实验分析[5–7].
在脑缺血和心脏缺血领域，蛋白激酶C（PKC）已被证明起着核心作用[8–11]. 使用PKC抑制剂可以减少中风和缺血性心脏病期间血管系统的病理变化[12–14]. 在眼睛中，PKC水平在几种缺血性条件下发生改变，包括糖尿病视网膜病变和中央静脉阻塞[15,16]. 然而，迄今为止，对PKC和视网膜缺血的研究主要涉及小动物和啮齿动物，重点是神经视网膜，而不是视网膜动脉[1,4]. 在这些模型中，报道了相互矛盾的结果，包括缺血后PKC表达的上调、下调和未改变水平[17–22]. 因此，我们认为，在视网膜缺血中，特别是在视网膜动脉中，绘制出这些不同的细胞内信号转导途径是非常重要的。在本研究中，我们选择检测视网膜缺血中的PKCα、PKCβ1和PKCβ2亚型。PKC有许多亚型，但PKCα、PKCβ1和PKCβ2是血管中常见的研究亚型，适用于中风和缺血性心脏病等其他缺血性疾病[11,12]. 这些亚型在调节这些疾病的发展中起着重要作用。此外，已经为这些亚型开发了特异性拮抗剂，以阻止与缺血相关的损伤。PKCα主要在双极细胞中表达，似乎是视网膜中最丰富的异构体[23]而PKCβ已被证明在糖尿病视网膜病变的发展中发挥作用[15].
本研究的目的是详细描述PKCα、PKCβ1和PKCβ2在视网膜缺血中的作用。我们使用了一个具有灵长类结构的猪眼睛模型，因为它适用于视网膜动脉和神经视网膜的分离分析。采用实时聚合酶链反应（qRT-PCR）、western blot分析和免疫荧光染色研究PKCα、PKCβ1和PKCβ2的mRNA和蛋白表达。
方法
动物和麻醉
本研究共使用了28头平均体重为70 kg的两性家猪（瑞典隆德的传统养猪场）。手术前一天晚上，动物们被拒绝进食，但他们可以自由饮水。每15 mg/kg体重肌肉注射100 mg/ml氯胺酮（Ketaminol vet™；Farmaceutici Gellini S.p.A，意大利阿普利亚），每2 mg/kg体重肌注20 mg/ml木聚嗪（Rompun vet™，德国勒沃库森拜耳股份公司），用于术前用药。通过持续静脉输注20 mg/ml异丙酚（得普利麻™；阿斯利康，瑞典索德特列耶），剂量为0.1–0.2 mg/kg/min，并结合间歇性芬太尼（芬太尼B.Braun；B.Braun-Melsungen AG，德国梅尔松根），剂量约为3.5μg/kg/h，诱导麻醉。猪的平均动脉血压为92±7 mmHg。实验完成后，通过静脉注射2 mmol/kg钾（ADDEX氯化钾，Fresenius KABI SE，瑞典乌普萨拉）对动物实施安乐死。所有程序和动物治疗均按照隆德大学伦理委员会、实验动物研究所（实验动物护理和使用指南）的指南以及ARVO关于在眼科和视力研究中使用动物的声明进行。这项研究得到了农业部临终关怀所下属地区法院的批准。
缺血-再灌注
在手术过程中，每只动物的一只眼睛通过升高眼压（IOP）诱导缺血，而另一只眼睛作为对照。用30号针头对双眼后房进行插管。通过持续滴注平衡盐溶液进行眼部冲洗（Amo），一只眼的眼压提高到80 mmHg™内索尔™；荷兰格罗宁根AMO Groningen BV）。使用Tono-Pen®XL眼压计（佛罗里达州杰克逊维尔市Medtronic）监测压力。对照眼进行了相同的手术，但压力不允许升高。这只眼睛在文字和数字中被称为“假手术眼”。60分钟后，取下插管针，使视网膜血管再灌注。间接检眼镜检查发现视网膜动脉发白，证实缺血。这在眼压升高后、缺血期间（30分钟后）和缺血结束时（60分钟）都得到了证实。
组织准备
再灌注5小时、12小时或20小时（麻醉7/14/22小时）后，在麻醉期间将猪的双眼剜除，包括视神经。对眼睛进行了解剖；将眼前节和玻璃体切除，将玻璃杯分成两半。其中一半用于免疫荧光染色，而另一半视网膜从视网膜色素上皮中剥离。在4°C的缓冲溶液（用于眼冲洗的平衡盐溶液）中仔细解剖，从神经视网膜分离出动脉。动脉为一至三级分支。在视网膜动脉的剥离过程中，血液被轻轻地挤出血管。收集每个没有主要血管的剩余神经视网膜的中央和外围片段，并将其储存在−80°C下，直到用于qRT-PCR和western blot实验。在12小时再灌注组中，qRT-PCR分析中使用的一些样本包括整个视网膜，没有主要血管（n=8）。
RNA提取和实时聚合酶链反应
RNA以两种不同的方式提取。来自同一只猪的假手术和缺血再灌注眼的样本进行了相同的RNA提取程序。在相对变化中计算mRNA的差异（缺血手术眼的结果与同一只猪的假手术眼的比例）。综上所述，我们认为RNA提取的技术并没有影响我们的结果或结论。根据制造商的说明，使用第一种技术，我们使用金属球和TissueLyser（Retsch，Haan，Germany）在1 ml TRIzol（Invitrogen，Carlsbad，CA）中均质组织。接下来，添加200µl氯仿以从DNA、蛋白质和细胞碎片中分离RNA。在离心之前，允许匀浆在室温下分离。将上清液转移到新试管中，并添加500μl异丙醇；然后将样品在-20°C下培养过夜，以使RNA沉淀。将样品离心，以进一步沉淀RNA。去除上清液，并用500μl 75%乙醇清洗一次RNA颗粒。去除上清液，干燥颗粒，然后将其溶解在无钠水中。样品在冰上培养1小时，使RNA颗粒完全溶解。使用分光光度计在260 nm和280 nm处测量光吸收率，并记录RNA浓度和RNA/DNA比率。第二种技术是使用RNeasy Mini-kit（加利福尼亚州巴伦西亚的齐亚根）提取RNA，可以同时提取蛋白质。简单地说，如前所述，使用金属球和TissueLyser在600μl RTL缓冲液中均质组织。将裂解液离心除去不溶性物质，并小心地将上清液转移到新的试管中。添加一体积的70%乙醇，然后将样品置于RNeasy微型柱上并离心。保留流通液用于蛋白质提取（详见下文）。用RW1缓冲液和RPE缓冲液清洗柱，用30μl无钠水洗脱RNA。用分光光度计测量光吸收率，并记录RNA浓度和RNA/DNA比率。从每只眼睛的视网膜动脉中提取4-8μg总RNA，从神经视网膜中提取15-30μg总RNA。
使用GeneAmp RNA聚合酶链反应试剂盒在Perkin-Elmer DNA Thermal Cycler（加州福斯特市Perkin-Elmer Applied Biosystems）中进行总RNA到cDNA的反转录。用随机六聚体作为引物，通过40μl反应，从1μg总RNA合成第一链cDNA。反应在42°C下进行90分钟，然后在72°C下运行10分钟。qRT-PCR在GeneAmp 7300实时PCR系统中进行，使用GeneAmp-SYBR®Green试剂盒（Perkin-Elmer，Applied Biosystems），以先前合成的cDNA为模板，在25μl反应中进行。所有实验均采用无模板对照。GeneAmp 7300系统通过荧光染料与双链DNA的结合，使用光学成像系统实时监测DNA的扩增。猪的特异性引物PKCα,PKCβ1、和PKCβ2在中进行了描述.结果是相对于家政基因的数量进行计算的β-肌动蛋白和延伸系数-1α(EF-1α)，因为这些在细胞中以恒定数量持续表达[24]. 这些管家基因的引物序列如下所示.
根据制造商的说明将引物溶解在水中，并制作反向和正向引物的混合物。qRT–PCR按照以下模式进行：1个50℃循环2分钟，95℃循环10分钟，然后40个95℃循环15秒，60℃循环1分钟。然后进行分离，1个95℃周期15秒，50℃循环30秒，95℃持续15秒。为了检查β-肌动蛋白,EF-1α、和PKC公司在qRT-PCR过程中以相同的效率扩增s，我们构建了一条标准曲线，其中C值吨根据以下等式绘制cDNA浓度图：
哪里E类是放大效率，最佳值为1。金额PKC公司标本中的mRNA是相对于β-肌动蛋白和EF-1α同一样本中的mRNA使用关系，
哪里X（X）0等于原始金额PKC公司mRNA，R（右）0等于原始金额β-肌动蛋白mRNA，C类信托收据是C类吨的值β-肌动蛋白、和C类德克萨斯州是C类吨的值PKC公司.
蛋白质提取和蛋白质含量测定
从RNA提取中收集流通液，并与4体积的冰冷丙酮在−20°C下孵育30分钟。然后将样品在4°C下以16000 xg离心10分钟，并丢弃上清液。蛋白质颗粒经空气干燥后再悬浮在8M尿素中。使用BioRad DC试剂盒（加利福尼亚州Hercules市BioRads）测定总蛋白浓度，并使用微孔板光度计（马萨诸塞州沃尔瑟姆市Thermo）测量750 nm处的吸光度。蛋白质样品立即用于蛋白质印迹分析，或在使用前储存在−80°C。从每只眼睛的视网膜动脉中提取100-200μg蛋白质，从神经视网膜中提取1-2 mg蛋白质。
蛋白质印迹
分别在神经视网膜和视网膜动脉中评估感兴趣的蛋白质。将蛋白质样品与NuPAGE LDS样品缓冲液（Invitrogen）混合并煮沸5分钟。将等量的蛋白质（神经视网膜30μg/车道，视网膜动脉20μg/通道）加载到NuPAGE 4%–12%双三凝胶（Invit罗gen）上，并用SDS–PAGE分离。将分子量标记（SeeBlue®Plus2；Invitrogen）加载到每个凝胶上，用于蛋白质带鉴定。分离后，将蛋白质转移到硝化纤维素膜上（明尼苏达州明尼托卡市GE Osmonics）。随后用PBS中6.5%的脱脂牛奶（0.14 M NaCI，0.01 M PO）封闭膜4缓冲液，0.003 M KCI，pH 7.45）在4°C下过夜，并用0.1%吐温-PBS（T-PBS）洗涤三次，每次15分钟。然后在4°C下将膜与感兴趣的主要抗体孵育过夜：1:1000小鼠抗PKCα（Nordic BioSite，瑞典塔比）、1:500兔多克隆抗PKCβ1（Nordic BioSite）、1:50兔单克隆抗PKCβ2（NordicBioSite，1:1000兔多克隆磷酸特异性抗PKCβ2（Biosource）或1:5000小鼠单克隆β-actin（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cru z，CA）。培养后用T-PBS洗涤三次，每次15分钟。然后在室温下将膜与适当的二级抗体孵育4小时：1:500猪多克隆抗兔IgG-辣根过氧化物酶或1:500兔多克隆抗鼠IgG辣根过氧化物激素（丹麦格洛斯特鲁普达科）。然后用T-PBS将膜清洗三次，每次15分钟。β-肌动蛋白水平用于确认车道的荷载相等。使用Amersham ECL Plus Western Blotting检测试剂（英国白金汉郡GE Healthcare）开发膜，并使用Fujifilm LAS-1000发光图像分析仪（康涅狄格州斯坦福德Fujifirm）进行可视化。
免疫荧光染色
每半只眼睛在4%多聚甲醛中固定5小时。固定后，在0.1 M瑟伦森磷酸盐缓冲液（28 mM NaH）中冲洗组织2人事军官4和72 mM Na2高功率放大器4；pH值7.2），然后在相同的溶液中清洗，增加蔗糖浓度（5%至25%）。将标本包埋在30%的蛋清和3%的明胶中，并在-80°C下保存至切片。在低温恒温器（Microm HM500M；Thermo Scientific，Walldorf，Germany）中以12µm的深度连续切片，并放置在显微镜载玻片上（Menzel，Braunschweig，German），每张载玻片三个切片。让载玻片在室温下干燥30至60分钟，然后在-20°C下保存，直至再次使用。
将抗-PKC切片在PBS和0.25%Triton X-100的混合物中渗透15分钟，然后在室温下在PBS、1%BSA和5%正常血清中封闭1小时。将标本与1%牛血清白蛋白和2%正常血清以及感兴趣的一级抗体在4°C下孵育过夜：1:200兔多克隆磷酸化特异性抗PKCα（Biosource）、1:100兔多克隆磷酸化特异性抗PKCβ1，1:10小鼠单克隆抗CD31（AbD Serotec，牛津，英国）和1:200小鼠单克隆反平滑肌肌动蛋白（Santa Cruz Biotechnology）。CD31，也称为PECAM-1，由多种细胞类型表达，尤其是内皮细胞[25]. 平滑肌肌动蛋白通常用于检测平滑肌组织。用PBS缓冲液清洗切片，并与适当的二级抗体、1:200异硫氰酸荧光素山羊抗兔抗体（Cayman Chemicals，Ann Arbor，MI）孵育，以定位神经视网膜中的磷酸特异性抗PKCβ1和PKCβ2，以及1:50异硫氰酸荧光素猪抗兔抗体以及1:200德克萨斯红驴抗鼠剂（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch）在所有其他样品上在室温下放置1小时。在用PBS缓冲液进行额外清洗后，将载玻片安装在防褪色安装介质中（Vectashield；Vector Laboratories Inc.，加利福尼亚州伯灵盖姆）。在本研究中，定位蛋白质表达的免疫荧光技术仅用于检测PKC的磷酸化形式。特异性PKC同工酶的非磷酸化形式预计将在与磷酸化形式的PKC同功酶相同的细胞中表达。用western blot定量磷酸化PKC和总PKC。
在缺血和再灌注20小时的组中，从四只猪的视网膜中央检查包括视神经头在内的垂直切片。用PKC和CD31或平滑肌肌动蛋白在一到两头猪的切片中进行配伍。用配备荧光显微镜的光学显微镜（蔡司Axiophoto；德国奥伯科兴卡尔蔡司）观察染色强度，并用附带的数码相机（蔡司AxioCam）拍摄照片。为了进行染色强度比较，同时处理缺血再灌注眼和相应对照的切片，以最大限度地减少变异性。
统计分析
使用配对学生比率进行统计分析t吨-测试和GraphPad 5.0软件。使用Bonferroni校正手动进行多重比较校正，该校正是通过将p值乘以所执行分析的数量来计算的。不同的引物和抗体被视为单独分析，它们之间没有进行校正。文本和图中给出了精确的p值（在Bonferroni校正后）。数值表示为平均值±平均值标准误差（SEM）。
限制
从视网膜动脉中提取的蛋白质和mRNA数量少于从神经视网膜中提取的。由于材料数量有限，我们重点分析视网膜动脉和神经视网膜中PKC的磷酸化形式，而只分析神经视网膜样品中的总PKC。由于技术原因，我们无法从暴露于缺血和再灌注5小时的眼睛样品的蛋白质分析中获得任何结果。出于道德原因，我们选择不为这些实验再牺牲六头猪。
结果
实时PCR
PKCα,PKCβ1、和PKCβ2缺血再灌注5h、12h和20h后，视网膜动脉和视网膜神经中的mRNA水平往往低于手术后的眼睛(); 然而，这些差异并没有达到统计显著性（有关精确的p值，请参阅).
视网膜动脉和神经视网膜中PKC mRNA水平。PKCα,PKCβ1、和PKCβ2通过实时PCR评估mRNA表达水平(A类)视网膜动脉和(B类)缺血和再灌注5小时（n=6）、12小时（n=14）或20小时（n=6）时，神经视网膜与假手术眼相比。数值表示为平均值±SEM。使用Student的配对比率进行统计比较t吨-Bonferroni校正试验（缺血再灌注与半手术）。图中给出了精确的p值。请注意PKCα,PKCβ1、和PKCβ2视网膜动脉和神经视网膜的变化模式相似。
类似的模式PKCα,PKCβ1、和PKCβ2使用时可观察到mRNA表达β-肌动蛋白作为参考基因或与EF-1α（数据未显示），表明这些基因是可靠的参考。每对引物的标准曲线具有相似的斜率（3.4PKCα，3.3用于PKCβ1，3.3用于PKCβ2和3.3用于β-肌动蛋白)，表明PKCα,PKCβ1,PKCβ2、和β-肌动蛋白cDNA扩增效率相似。各斜率值接近3.3，放大效率接近1.0，为最佳。
蛋白质印迹
缺血12 h和20 h再灌注后视网膜动脉中磷酸化PKCα和PKCβ2的蛋白水平较假手术眼低(). 这些差异没有达到统计学意义。神经视网膜也有类似的变化模式(). 缺血再灌注后，神经视网膜中的总PKCα、PKCβ1和PKCβ2略低(). 磷酸化PKCβ1在western blot上仅显示弱条带，不足以进行可靠的定量分析。
视网膜动脉和神经视网膜中的PKC蛋白水平。通过western blot评估磷酸化和总PKCα、PKCβ1和PKCβ2蛋白表达水平(A类)视网膜动脉和(B类)视网膜神经，缺血眼和再灌注12（n=7）或20（n=5）小时眼与假手术眼相比。右面板是再灌注20小时组动物的神经视网膜和视网膜动脉的western印迹的代表性示例。数值表示为平均值±SEM。使用Student的配对比率进行统计比较t吨-Bonferroni校正试验（缺血再灌注与假手术）。图中给出了精确的p值。
免疫荧光
在视网膜动脉中，磷酸化PKCα、PKCβ1或PKCβ2的免疫荧光染色主要定位于内皮细胞(). 用内皮细胞标记物CD31染色观察内皮细胞。血管平滑肌层也可见较低程度的弱染色，这在磷酸化PKCα中最为明显().
视网膜动脉和神经视网膜中的PKC免疫反应。显示缺血和再灌注20小时后视网膜动脉和视网膜中磷酸化PKCα、PKCβ1和PKCβ2免疫反应性的代表性实例。答：CD31（也称为PECAM-1）是一种内皮细胞标记物，双染色显示磷酸化PKC在内皮中的共定位（箭头）。平滑肌层也可见弱磷酸化PKC染色。B类：根据western blot，缺血再灌注后神经视网膜中观察到的PKCα、PKCβ1和PKCβ2水平较低，反映在免疫荧光染色结果中，显示缺血再灌注眼与假手术眼相比，磷酸化PKCα和PKCα2染色较少。此外，磷酸化PKCβ1染色显示，与假手术眼相比，缺血再灌注眼中标记的双极细胞小体更少（参见p-PKCβ一图片中的插入内容）。在所研究的所有猪中也观察到类似的结果。缩写：外核层（ONL）、外丛状层（OPL）、内核层（INL）、内网状层（IPL）、神经节细胞层（GCL）和神经纤维层（NFL）。
视网膜动脉平滑肌层PKC免疫反应。显示缺血和再灌注20小时后视网膜动脉中磷酸化PKCα、PKCβ1和PKCβ2免疫反应的典型示例。平滑肌肌动蛋白（平滑肌标记物）的双重染色显示，平滑肌层与磷酸化PKC共定位（箭头所示）。注意，磷酸化PKCα的共定位最明显。
在神经视网膜中，染色局限于双极细胞(). 与对照眼相比，缺血再灌注眼的神经视网膜中的磷酸化PKCα和PKCβ2染色强度较低。此外，磷酸化PKCβ1染色显示，与假手术眼相比，缺血再灌注眼中标记的双极细胞小体更少（参见p-PKCβ一图片中的插入内容）。
讨论
视网膜缺血是由循环衰竭引起的，循环衰竭起源于血管系统。到目前为止，大多数研究都集中于确定治疗视网膜缺血再灌注损伤的神经保护剂。视网膜血管是循环衰竭的关键器官。因此，我们的目的是研究视网膜血管系统与神经视网膜的区别，以确定参与视网膜循环衰竭后损伤发展的细胞内信号传导途径，特别是PKC。
免疫荧光染色证实视网膜动脉中存在磷酸化PKCα、PKCβ1和PKCβ2。染色主要局限于内皮细胞。据我们所知，这是对缺血再灌注损伤后视网膜血管中PKC定位的首次分析。mRNA水平PKCα,PKCβ1、和PKCβ2缺血再灌注组的视网膜动脉明显低于假手术组。此外，缺血再灌注后磷酸化PKCα和PKCβ2的蛋白水平趋于降低，尽管这些结果没有达到统计学意义。与视网膜血管不同的是，血管系统已经根据其他器官的缺血情况进行了彻底的分析。PKC水平在中风期间的脑血管系统、缺血性心脏病期间的冠状动脉以及糖尿病导致的一些组织中发生变化[12,26,27]. 事实上，PKC抑制剂已被证明可以阻止血管壁病理性受体表达的发展，并降低大鼠大脑中动脉闭塞和蛛网膜下腔出血后中风损伤的程度[12,13]. 也发现PKC拮抗剂抑制冠状动脉病理性受体表达的发展[14].
磷酸化PKCα、PKCβ1和PKCβ2的染色强度在神经视网膜的双极细胞中尤为显著。PKC亚型在各种动物中的发生已经得到了彻底的研究，在哺乳动物中的研究证实了神经视网膜双极棒细胞中PKCα和PKCβ的免疫荧光染色的存在[28]. 在本研究中，缺血再灌注眼的PKCα、PKCβ1和PKCβ2 mRNA水平以及神经视网膜中的蛋白表达均低于假手术眼。以前的研究使用多种缺血模型，报道了关于视网膜缺血对神经视网膜PKC表达影响的相互矛盾的结果[20–22]. 这种差异的原因可能是由于缺血性损伤的类型和严重程度，以及所研究的动物模型。如本研究所观察到的，缺血后PKCα免疫反应的类似下调在兔视网膜中也有报道[21].
从目前的研究中无法推断是单独的缺血还是再灌注触发了PKC的改变。然而，人们普遍认为，正是缺血和随后的再灌注引发了缺血再灌注损伤后的变化[1]. PKC mRNA和蛋白水平降低的机制尚不清楚，但可能与PKC转录和翻译减少有关，这是由缺血期间改变的体液因子触发的。人们相信钙蛋白酶，一种钙2+-依赖性蛋白酶，可能负责脑缺血再灌注后某些PKC亚型（包括PKCβ）的蛋白水解[29]. 此外，PKC蛋白的去磷酸化可能使PKC对蛋白水解更敏感。在动物模型中，PKC抑制剂已被证明可以防止缺血事件后心脏和大脑损伤的发展[10,12]. 然而，PKCβ特异性抑制剂的作用，{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“LY333531”，“term_id”：“1257370768”}}LY333531号，已在视网膜血管疾病治疗的实验研究和临床试验中进行了研究，包括视网膜静脉阻塞和糖尿病视网膜病，但结果并没有像希望的那样有希望[16,30,31]. 关于PKC在视网膜缺血中的作用的知识仍然相当有限，并且由于相互矛盾的报道，PKC信号通路的功能在缺血损伤期间是否受损或扩增尚不清楚。
我们想监测视网膜缺血后组织损伤发展过程中细胞内信号转导途径的变化，在本例中为PKC。因此，在缺血事件后不同的再灌注时间后对视网膜进行检查。研究不同的再灌注持续时间可以深入了解最初的细胞内分子事件和随后的组织损伤。本研究侧重于最初的事件。再灌注5h时，缺血再灌注眼中PKCα、PKCβ1和PKCβ2的表达水平低于假手术眼。在更长的再灌注时间（12和20小时）后，缺血再灌注和假手术眼的PKC表达水平没有明显差异。这种变化模式可能反映了组织的初始损伤和恢复，PKC水平恢复到基线水平。然而，目前的研究无法推断PKC的下调是保护性的，还是组织损伤有害过程的一部分。
猪的眼睛具有典型的灵长类结构，包括视网膜血管，这对实验分析很有用[5–7]. 通过升高眼压60分钟来诱导视网膜缺血。此时间段通常用于诱导高眼压缺血再灌注。高眼压缺血再灌注是实验性视网膜缺血研究的常见模型[1]在包括大鼠和兔子在内的几个物种中都有描述。高眼压会导致全身缺血，视网膜和葡萄膜循环受阻，眼底变白，虹膜苍白。众所周知，该方法可产生与视网膜中央动脉阻塞后所见类似的病理特征[1]. Siliprandi等人[32,33]在猫身上显示，眼压升高后的视网膜损伤是由缺血性损伤引起的，而不是压力本身增加的结果。在本研究中，使用80 mmHg的眼压进行间接眼底镜检查，发现动脉发白，视网膜苍白，这表明眼压水平足以停止血流。本研究的一个局限性是没有测量视网膜中的氧张力。研究表明，猪视网膜在高眼压时也可以保持视网膜氧张力[34]作为自动调节的结果。在本研究中，结果有一些变化。不能排除这种自我调节至少解释了我们研究结果中的一些可变性。此外，以前曾报道过对缺血性损伤的抵抗力的个体间差异，这可能解释了一些结果的差异[1].
在本研究中，视网膜动脉从神经视网膜中分离出来并分别进行分析。视网膜动脉可能受到神经视网膜的轻微污染，反之亦然。不幸的是，这是无法避免的。神经视网膜的污染物可以通过使用消化酶（如胰蛋白酶）或渗透休克（如蒸馏水）从视网膜动脉中清除[35]. 然而，渗透性休克主要是一种将动脉和静脉一起提取的方法。此外，胰蛋白酶处理的样品不能用于实时PCR和western blot实验。
总之，视网膜的血管是循环衰竭的关键，因此我们分别分析了视网膜动脉和神经视网膜。缺血再灌注眼视网膜动脉和神经视网膜中PKC mRNA和蛋白的水平均低于假手术眼。目前尚不清楚PKC是否参与细胞生存信号传导或介导有害过程。本研究增加了对缺血后视网膜损伤发展中所涉及的信号转导途径的认识。这些信息可能有助于确定药物治疗的新靶点。
鸣谢
本研究得到了瑞典医学研究委员会、隆德大学医学院、瑞典政府临床研究拨款、隆德学院医院研究拨款、瑞典医学协会、隆德皇家生理学会、奥克·威伯格基金会、，安德斯·奥托·斯瓦德基金会/乌尔里卡·埃克隆德基金会、麦格纳·伯格瓦尔基金会、克拉福德基金会、安娜·利萨和斯文·埃里克·尼尔森基金会、詹森基金会、克伦普林赛桑·玛格丽塔斯·阿贝茨纳、辛斯卡达德、辛斯卡戴德·伊·马尔莫胡斯·、安娜奥赫·埃德文·伯杰基金会、，和Lars Hiertas Minne基金会。
工具书类
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