在囊性纤维化基金会研究发展项目的资助下Salipate实验室负责从科林·马诺尔博士实验室开发的有序铜绿假单胞菌突变库中分发克隆。有关更多信息和订单，请访问：https://sites.google.com/uw.edu/salipante-lab#h.cttrds7b03tz.
铜绿假单胞菌突变体库
从 铜绿假单胞菌 PAO1转座子突变库（Jacobs等人，2003年）。PNAS 10014339； Held等人2012年。细菌学杂志。，194, 6387-6389)
阵列的应变铜绿假单胞菌PAO1 Two-Allele Transposon突变库可通过华盛顿大学的非盈利成本中心向研究团体收费。库和转座子突变池的完整副本也可用。这些菌株已经过单菌落纯化，大多数非必需基因有两个突变株。关于该库的深入信息可在以下出版物中找到：Jacobs等人，2003年，PNAS 100:14339和Held等人，2012年，细菌杂志。194:6387. 附带的Excel文件(PA双等位基因文库)列出了可用的变种。
请求单个突变体
Excel库文件（可以从下面的链接下载）提供了关于双等位基因库中每个突变的信息。大多数列标题都是自我解释的。文件的第二页（“图例”）上也有列标题的说明。我们很抱歉，但作为一个小型研究实验室，如果我们的转座子在突变体中的位置无法确认或被错误分配，我们就不能发送替代品。我们非常感谢您了解确认状态，并将使用结果更新我们的库文件，以帮助未来的用户。
要请求个别变种人，请填写与您的机构类型相对应的订单（学术或非学术，链接位于本页底部），并将填写好的Excel文件发送至pamutant[a t]uw.edu。订单中有一张说明书，但如果您对表单本身、变体或订购过程有任何疑问，请告知我们。
对于需要进口或其他许可证的国家的请求请求者必须获得必要的许可证，并将副本通过电子邮件发送至pamutant[地址]uw.edu。因未能提供所需许可证而产生的所有费用将由申请人支付，包括海关拒绝后的退货费用。虽然首选电子邮件，但许可证副本可以传真至Manoil实验室，电话：+1-206-685-7301。
对于大多数订单，我们可以接受通过采购订单号、支票、银行转账或信用卡付款。信用卡付款可以通过安全网站进行；该网站的链接将与发票一起提供。 对于1000美元或以上的订单，我们要求将采购订单与订单一起通过电子邮件发送。
菌株的选择
在创建这样一个大型的阵列变体库时，不可避免地会有一些作业无法检出。此外，高通量的增长和分布可能导致一些混合培养物。
我们已经通过菌落纯化和两轮插入位置测序尽最大努力减少交叉污染和插入错误分配（但不缺少相应的野生型基因）。
如果我们获得了两个或多个与所称插入位点500bp内相对应的Sanger测序读数，则Sanger确认列中有一个+。如果我们能够通过对整个库的池执行Tn-seq来检测所调用插入站点的确切序列，那么Tn-seq-confirmated列中会有一个+。如果我们能够通过库池的Tn-seq在所调用插入位点的100bp范围内检测到一个插入位点，并且用于调用该位置的Sanger读取不是准确的读取，那么Tn-seq-confirmed列中有一个（+）。基本上，Tn-seq的确认表明转座子插入位点存在于文库中，但它并没有说它在指定的孔中，而Sanger测序是在特定的孔上进行的。因此，我们相信我们最高质量的插入位置是桑格和Tn-seq确认的位置。
我们对大多数基因进行了不止一次的插入，并且建议需要与感兴趣的基因对应的多个突变体在个别突变体无法确认的情况下，帮助提供覆盖范围。不幸的是，我们无法为无法确认的变种人提供替代品。
菌株的接收和维护
单个菌株作为半固体琼脂中的刺培养物发送。收到突变株后，重要的是在受体实验室将菌株样本保存为冷冻库存（-80°C）。我们建议研究人员从刺伤处开始，在LB琼脂（不含抗生素）等营养培养基上划线 收到后，立即从致密部分冻结库存的连续记录（在含有5%DMSO v:v的LB中）。
执行质量控制以确保向您发送可行的库存。您所请求的菌株可能因其所含突变而仅在短时间内存活，并且在装运后无法恢复。一旦一个品种已经发货并且在当时可行，如果没有额外的订单，将不会退款或重新发货。
菌株的确认
我们还敦促研究人员在使用前通过PCR或测序检查突变体的身份。我们建议研究人员使用侧翼引物和转座子特异性引物与侧翼引子配对，通过PCR对每个菌株的至少10个分离菌落进行检测，以确认突变体。
对于每个感兴趣的基因，研究人员应该设计侧翼引物或使用Excel文库文件（“PA双等位基因文库”）中列出的引物（由华盛顿大学GC的Mike Jacobs设计）。这些引物是计算机生成的，我们尚未对其进行测试。应首先使用野生型亲本菌株对它们进行测试，以验证是否产生了合适的野生型带。对于插入菌株，同一PCR应产生无条带或与非常大的产物对应的条带。
为了证明转座子插入的存在，使用转座子特异性引物和其中一个侧翼引物。每个菌株中使用的转座子列在库Excel文件的K列中。如果使用的转座子是ISphoA/hah，则使用引物hah减去138（5'gggtaacatatcccct-3'），如果转座子为ISlacZ/hah，则使用lacZ 148（5'-gggtaacgccaggtttcc-3'）。根据转座子相对于基因的方向，转座子引物应与侧翼引物之一结合使用。本页底部的“应变确认程序”链接中有关于该程序的其他信息。
有时，纯化转座子突变株在上述PCR中产生野生型和插入突变带。我们怀疑这些通常是携带野生型和插入突变等位基因的细菌，由包含感兴趣基因的串联重复的一个拷贝中的转座子插入引起。这种菌株经常被发现用于生存能力需要野生型功能的基本基因。
当您确认或无法确认突变株时，请发送电子邮件至pamutant[at]uw.edu，让我们知道您的结果。
应变变化原因墨西哥湾突变
在墨西哥湾PAO1菌株常见的基因，包括MPAO1和我们转座子突变文库中的突变体。之所以出现这种变异，是因为MPAO1及其突变体在墨西哥该基因导致MexT调节因子的组成活性。组成性MexT活性减缓生长并降低冷冻菌株的存活率，（不同）墨西哥湾-因此，在冷冻的突变体库或菌株传代过程中，负突变可以得到富集。这个墨西哥湾-负突变体可以与墨西哥湾-加菌株，因为它们形成的菌落稍大，对氯霉素（在含有10微克/毫升氯霉素的LB琼脂上测试）和萘啶酸（在添加64微克/mL萘啶酸的LB上测试）更敏感。描述这种变异的两篇论文是：Luong PM等人铜绿假单胞菌PAO1菌株涉及多种突变墨西哥湾或墨西哥法郎《细菌学杂志》。2014;196(2):504-513. doi:10.1128/JB.01050-13和Lee等人，重建野生型铜绿假单胞菌参考菌株PAO1。细菌学杂志。2021; 203（14）：e00179-21网址：10.1128/JB.00179-21。
共用转座子突变库
我们的铜绿假单胞菌转座子突变集合文库是通过MPAO1中的饱和水平转座子构建的。为了获得高插入密度，我们使用了一个来自Tn5的低插入特异性转座子。为了限制极性引起的错误分配，转座子携带了一个设计用于表达下游基因的外向启动子。在含有60mg/mL四环素的LB上选择突变体。在我们的Tn-seq中，发现该池包含大约110000个独特的插入位点。更多信息可在PNAS中找到。2015 112(16):5189. doi:10.1073/pnas.1422186112。泳池以1-mL等分样品出售，滴度超过10^9个细胞/mL。价格见相关订单。
订购完整的阵列库副本和池库.
完整的阵列图书馆和集合图书馆订单可以通过以下方式启动：通过pamutant[地址]uw.edu联系我们，或者填写Excel订单（说明见第一页），然后将表单通过电子邮件发送至pamutant[地址]w.edu。当前定价显示在相关订单上（学术或非学术）。
在复制整个库以供分发时，需要执行几个质量控制步骤。通过浊度的视觉评估来评估菌株的生长情况，生长不好的菌株单独生长，并包含在补充板中。桑格测序是在一个子集的微孔上进行的（约占文库的3%），以确保板的方向和文库的完整性（通常<2%的突变体提供意外的序列）。
突变体名称和基因型
在出版物中，请按菌株名称（PW####）引用Two-Allele Library中的菌株。按以下方式参考基因型：基因名称（如果没有基因名称，则为PAORF）-井名（位置字段的最后三位数字）作为等位基因编号：：转座子名称（ISphoA/hah或ISlacZ/hah）。例如，对于菌株PW1001，基因型为recF-B10:：ISphoA/hah，而对于菌株PW3003，基因型是PA0005-E05:：ISlacZ/hah。请确认Held等人，2012年，《细菌杂志》。194:6387关于使用这些菌株产生的出版物。
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PA双等位基因文库（Excel电子表格）
关于PA双等位基因库的更多信息