将XO/XS克隆移动到表达式载体的协议v.10.4.2010
材料：
Nunc烧结深井板编号：278011Nunc玻璃纤维96-well滤板编号：278010Eppendorf Perfectprep质粒96 Vac，直接结合试剂Cre重组酶新英格兰生物实验室#M0298L受体载体：pMK33 CFH BD、pMK33-CHF-BD、pMK33 CTAP BD、pMK33 NTAP BD房屋最大效率DH5a化学活性细胞英维特罗根#18258-012LB/氯/7.5%蔗糖房屋
接种供体BO或BS克隆（在pDNR-双载体中）：
- 从储备XO或XS板中接种5uL细胞到1mL 2xYT/羧苄青霉素中
- 将生长块置于37°C培养箱/摇床中，以300RPM的转速摇晃16-18小时
DNA准备：
- 继续Eppendorf Perfectprep Plasmid 96 Vac，Eppendor’s中概述的直接结合DNA制备协议手册，但以下情况除外：
- 例外#1：代替埃彭多夫；s滤板A，使用Nunc的烧结深井板
- 例外#2：使用Nunc的玻璃纤维96-well滤板代替Eppendorf的滤板DB
- 注：Nunc过滤器的高度比Eppendorf过滤器高约3mm，因此用作支撑滤板DB的适配器的测微计板对于玻璃纤维滤板来说太高了。使用折叠的纸巾代替。
- 像往常一样，用60uL ddH2O洗脱DNA。
- 读取几个孔的规格读数（例如A1、A12、H1、H12），以获得DNA浓度的近似值用于板。
Cre反应：
| 每口井： |
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| XO或XS供体克隆（100-400ng） |
1-5微升 |
| 接受向量（200ng） |
1.0微升 |
| 10X Cre反应缓冲液 |
2.0微升 |
| Cre重组酶 |
2.0微升 |
| dH2O |
至20微升 |
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20微升 |
注：我们使用供体克隆DNA与受体载体的质量比为1:1。
在PCR机器中执行：
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| 37摄氏度 |
15分钟 |
| 70摄氏度 |
10分钟 |
| 4摄氏度 |
∞ |
转型
- 在冰上解冻Max Efficiency DH5a化学活性细胞5-10分钟。你需要5管细胞（总计约1250uL）每板96个Cre反应。
- 将13uL活性细胞等分放入冰上冷冻的带裙PCR板的每个孔中。
- 将1.3uL Cre反应加入到活性细胞和吸管中，并旋转混合。
- 用铝箔板密封剂密封PCR板的顶部。
- 将PCR平板置于冰上培养30分钟。
- 在42°C水浴中加热休克细胞35秒。
- 将细胞放回冰上2分钟。
- 取下箔板密封剂并向每个孔中添加150uL SOC。
- 用透气板密封剂密封PCR板的顶部。
- 将PCR板放在其底座中，并将板放在37°C、250RPM的摇动培养箱中1小时。
- 将整个样品置于LB/Clor/7.5%蔗糖板上。
选择菌落：
- 在500uL 2XYT/Chlor培养基中为每个目标选择一个菌落。避免采集小菌落。
- 将生长块置于37°C培养箱/摇床中，以300RPM的转速摇晃18小时。
- 将隔夜生长块制成100uL冷冻库存（在7.5%二甲基亚砜中）。
**注：转换效率低。我们通常观察到每次转化少于10个菌落。
水处理和顺序：
- 水处理并用合适的底漆对5'端进行排序。
