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融合协议

版本08.08.05

材料：

多普勒指数（20U/uL）

NEB编号R0176L

10毫米dNTP

NEB编号：N0447L

Finzymes Phusion DNA聚合酶（2U/uL）

美赞臣研究#F-530L

TAM1活性细胞

活动主题#11096

融合PCR克隆试剂盒

BD生物科学#631775

LB/Amp/X-Gal板

PCR模板

将细菌库存中的5uL cDNA克隆接种到600uL LB/抗生素中

在37摄氏度下隔夜生长。

PCR反应

1:10细胞在3.0微升H2O中稀释

5X输液缓冲液4.0uL

10毫米dNTP 0.4微升

5uM 5'BD低聚物1.2uL

5uM 3'BD低聚物1.2uL

Phusion聚合酶0.15uL

dH2O10.05微升

总计20uL

98C 1分钟。

98C 10秒。

59C-->50C 30秒3次循环（退火温度每循环降低3C）

72C 2分钟。

98C 10秒。

50C 30秒13周期

72C 2分钟。

72C 5分钟。

4C永久

在1%琼脂糖凝胶上分析5uL。

注：对于携带氨苄西林耐药基因的PCR模板因为pDNR-Dual载体也是Amp，所以必须进行模板质粒^第页。这消除了起源亲本质粒被携带的可能性。此DpnI酶步骤对于PCR模板携带Amp以外的抗生素耐药基因，可以跳过。

DpnI摘要

PCR产物15uL

NEB缓冲区4.2uL

DpnI 0.5微升

硫酸二丁酯2.5微升

总计20uL

37C 2小时

80C 20分钟

G50 PCR产品

1.向水合物G50中添加300uL dH2O。

2.让平板在室温下放置3小时。

3.将水合G50板放在配有蓝色适配器的Nunc板顶部，以收集水。

4.旋转950xG 5分钟。

5.丢弃水。

6.向G50中添加额外的150uL dH2O

7.旋转950xG 5分钟。

8.丢弃水。

9.将G50板放在PCR板（E&K#489096）顶部。不需要适配器。

10.将组件放置在PCR板底座上。

11.将所有PCR产物转移到G50柱中，小心抽吸样品每个柱的中心。

12.旋转950xG 5分钟，在PCR板中收集样本。

13.应回收约15-20uL样品。

BD反应

G50'd PCR产物~2.0 uL（~100ng/kb）

10X输液反应缓冲液1.0uL

10倍BSA 1.0uL

pDNR-对偶线性化向量0.5uL

稀释输液酶0.5uL（储备量为10倍，用稀释缓冲液稀释至1倍）

dH2O5.0微升

总计10ul

在25℃下培养30分钟（注：对于大于3kb的ORFs：培养37℃15分钟，然后50℃培养15分钟分钟）

向BD反应中添加20uL TE。

储存温度-20C

转型

在冰上解冻TAM1细胞5分钟

向TAM1细胞添加1.5uL BD反应

轻轻敲打细胞以混合

在冰上培养30分钟

42℃下的热冲击电池30秒

将细胞放回冰上2分钟

添加150uL SOC

以250转/分的转速摇晃37℃40分钟。

全部电镀到LB/Amp/X-Gal板上

选择并准备末端排序

将白色菌落拾取到2XYT/Amp块中

一夜之间增长

制作冷冻存货，并将剩余部分转为DNA小制备

序列5'末端带有M13正向引物：TGTAAAACGACGGCCAGT

序列3'末端带有PDD3.1引物：GTTTTTTATTGGTGAATCCAAGC