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记录日期:2013年3月6日
所有内容的演练进行单标记和多标记免疫染色时需要考虑的重要因素和步骤。为了完整起见,某些实验设计步骤将在适当的地方重复,尽管您可以在我们的其他IHC资源. 本次网络研讨会将为您提供克服常见的IHC和ICC染色挑战所需的技巧和技巧,并从您的实验中获得最佳效果。
无法查看上面的图像?单击此处观看此网络研讨会.
本次网络研讨会分为两个主要部分——在IHC和ICC中用单个报告人标签染色和用多个报告人标签着色。
本次网络研讨会由Abcam高级成像科学家Simon Renshaw主持。Simon于布拉德福德大学然后,他继续在阿登布鲁克医院组织病理科在英国剑桥,他被介绍使用免疫组织化学和免疫荧光技术进行诊断。
Simon于2001年加入Abcam。作为一名高级成像科学家,他每天都与免疫细胞化学和免疫组织化学合作来验证我们的抗体。利用这些专业知识西蒙在Abcam期间举办了几次关于如何与国际商会和国际水文委员会合作的网络研讨会。
主持人
Judith Langenick,Abcam二级抗体产品经理
Lucy Purser,Abcam活动和营销经理
LP:您好,欢迎参加Abcam关于使用单个和多个标签的IHC/ICC染色技术的网络研讨会。今天的主讲人是Abcam的高级成像科学家Simon Renshaw。西蒙在布拉德福德大学完成了生物医学科学学位。之后,他在英国剑桥阿登布鲁克医院组织病理学系完成了BMS1培训。在那里,他被介绍使用免疫组织化学和免疫荧光技术进行诊断。Simon于2001年加入Abcam。
今天加入Simon的将是我们在Abcam的产品经理Judith。朱迪思在邓迪大学完成了分子生物学学位和博士学位。完成这项工作后,Judith转到剑桥的MRC分子生物学实验室,并于2011年加入Abcam。
只是为了让您知道,当您退出此次网络研讨会时,您将被重定向到一个网页,在那里可以找到演示文稿的可下载PDF副本。我现在将交给西蒙,他将主持这次网络研讨会。
SR:谢谢你,露西。大家好,欢迎参加本次Abcam网络研讨会,题为:使用单个和多个标签的IHC和ICC染色技术。正如标题所示,我将向您介绍在进行单标签和多标签免疫染色时必须考虑的所有重要因素和步骤。在稍后的演示中,我们将进行一个三个问题的测验,只是为了好玩,所以请注意那个家伙!
在我开始之前,值得注意的是,网络研讨会“通过仔细的实验设计优化IHC和ICC结果”涵盖了设计IHC与ICC实验的许多重要方面。这段视频可以在Abcam博客中找到*。今天的网络研讨会更侧重于使用单个和多个标签进行免疫染色的实际方面。然而,为了完整性,将在适当的情况下重申某些实验设计数据。
我们将完成并详细讨论以下内容。首先,IHC/ICC使用单一报告人标记第一天和第二天染色方案。第一天将包括热诱导和酶促抗原回收、缓冲液和洗涤剂、封闭缓冲液,最后是初级抗体培养。第二天将介绍内源性过氧化物酶的猝灭,简要介绍检测系统,讨论是否使用酶荧光报告标签,以及可用于酶检测的各种色素。然后,我们将继续讨论着色复染,最后再讨论安装。如果你想知道,我将在多重染色部分讨论荧光染色。在网络研讨会的第二部分中,我们将先从荧光的工作原理开始,然后再讨论荧光报告标签的组合,从而了解IHC和ICC使用多个报告标签的情况。然后,我们将讨论荧光与酶报告标签的比较,然后是同步染色,然后是顺序染色,最后是关于对照的一些讨论。
首先,我们将介绍一种通用的IHC或ICC协议,该协议适用于标记的二级抗体、聚合物或抗生物素-生物素复合物。正如您在过去的网络研讨会中了解到的那样,根据您的实验设计,每个步骤都有许多不同的变化。我将向您介绍每个协议步骤,并在需要时讨论任何常见的实验设计变体。网络研讨会最后一部分的重点将是使用多个标签设计实验。
我们将更详细地讨论这些问题,但值得快速讨论各个步骤和协议,以便让您了解接下来会发生什么。首先,在第一天进行任何预处理,如石蜡切片脱蜡和抗原提取。然后是洗涤阶段,接着是阻断非特异性蛋白质/蛋白质的相互作用,或者换句话说,非特异性染色,然后是另一次洗涤。然后在4°C下将初级抗体在样本上培养过夜。
然后我们继续第二天的工作,第一项工作是在阻断任何内源性过氧化物酶之前清除一级抗体;如果你确实使用了过氧化物酶报告标签。在此之后,是时候开始引入检测系统,并允许其在清洗之前进行孵化。如果您使用的检测系统是基于ABC的,您可以在此时添加ABC复合物。让它孵化并洗掉,但如果没有,你会跳过这一步。类似地,如果你使用的是一个酶报告标签,那么在洗掉它之前,你应该先在色原中孵育,如果没有,你也可以跳过这一步。如果你使用的是磷酸酶报告标签,那么此时你也可以阻止任何内源性磷酸酶。然后,在洗掉多余的颜料之前,再进行复染。如果你使用的是酶报告标签和不溶于酒精的显色剂组合,那么接下来你需要进行合并、脱水、澄清和安装程序。但是,如果没有,您也可以跳过这一步。最后,无论发生什么情况,你都要以某种方式安装染色标本,以帮助在显微镜分析之前、期间和之后保存它。
现在让我们更详细地讨论协议的第一步,它涉及执行任何所需的样本预处理,例如组织切片的脱蜡和抗原检索。抗原或表位检索可以打破醛固定过程中形成的亚甲基桥,使抗体能够接触到某些固定敏感的抗原。因此,只有在经过醛固定的标本上,并且只有在证明有固定敏感抗原的情况下,才有必要进行抗原回收。所有样本应放在涂布过的载玻片上,以防止分离。如果将冰冻切片和石蜡切片安装在涂有涂层的载玻片上,它们通常都能在抗原提取后存活下来,除非它们特别易碎,例如脂肪组织。有两种常用的抗原回收方法:热诱导法,简称HIER,它涉及使用合适的缓冲液,如柠檬酸三钠pH6或EDTA pH9。另一种是酶法,它需要使用合适的酶溶液,如胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶或蛋白酶K。这两种方法都可以作为免疫染色平台的一部分或独立的抗原回收容器并入自动化系统。但如果手动进行,热诱导抗原回收通常在压力锅或微波炉中进行,而酶则在水浴中进行。
以下抗原检索协议是通用的,集中于使用pH6柠檬酸三钠、热诱导抗原检索和酶促糜蛋白酶的上述方法。然而,请记住,没有通用的抗原检索解决方案。对于每个抗原,必须确定最合适的抗原回收溶液或酶、pH值、方法和持续时间。
因此,为了进行热诱导抗原回收,首先要通过将5.88 g柠檬酸三钠、44 mL 0.2 M盐酸和1956 mL超纯水混合在一起,预先制备柠檬酸三钠盐缓冲液。然后用1 M氢氧化钠和盐酸将其调节至pH值6,然后倒入压力锅,用足够的体积将载玻片覆盖约1 cm。
然后把高压锅本身放在电炉上,把盖子盖在上面,我的意思是不要把它固定下来。然后打开加热板,使缓冲液沸腾。
在等待压力锅煮沸时,将所有石蜡切片放在适当的架子上进行脱蜡和再水化,然后分别换三次二甲苯,每次换三次酒精,每次换3分钟,然后再换冷运行的生活用水。把它们放在自来水中,直到高压锅沸腾。通过脱蜡,二甲苯去除蜡,然后酒精去除二甲苯,最后水去除酒精。换言之,由于有机液体和水溶液都与酒精混合,所以使用乙醇作为中间相,载玻片从有机相进入水相。
缓冲液沸腾后,将载玻片从自来水转移到压力锅,注意热溶液和蒸汽。按照制造商的说明固定压力锅盖,一旦压力锅达到满压,设置计时器3分钟。3分钟后关闭加热板,将压力锅放在空水槽中。
启动泄压阀,将家用冷水供应到炊具上,以帮助减压。减压后,打开盖子,将家用冷水倒入炊具10分钟,再次注意热溶液和蒸汽。您现在可以继续使用免疫染色方案了。
请注意,可以根据使用的缓冲液、pH值和抗原检索的持续时间修改本协议。3分钟的持续时间只是一个建议的起点;少于3分钟可能会使抗原未被提取,超过3分钟可能使抗原被过度提取,这可能导致假染色或背景染色,并可能增加切片与载玻片的分离。因此,建议进行优化,将载玻片恢复到免疫化学染色前的1、3、5、10和20分钟。此协议可以很容易地修改以用于微波炉,但始终从缓冲区沸腾时开始检索计时。如果你选择使用微波炉,建议使用带有温度探针和搅拌功能的科学微波炉,以防止回收溶液剧烈沸腾;从而有助于区段分离和消除冷点。最后,也可能是最重要的一点,请遵循制造商关于安全使用实验室中的特定压力锅或微波炉的说明。请同时遵守您正在使用的任何化学品的健康和安全指南。
现在让我们看看酶抗原检索协议。首先将水浴温度设置为37°C。接下来,获得两个足够大的水槽,以容纳机架滑块,并向每个水槽中添加足够量的超纯水,以覆盖滑块。将水槽放入水浴中,使超纯水的温度加热至37°C。
按照热诱导抗原回收方案中的规定,对所有石蜡切片进行脱蜡和复水,并将其放入37°C的超纯水槽中加热。
取下另一槽超纯水,用磁力搅拌器将0.1 g氯化钙和0.1 g糜蛋白酶溶解于100 mL超纯水中,以确保所有试剂均被正确溶解。
溶解后,使用1 M氢氧化钠和盐酸将溶液调至pH值7.8,然后再将槽返回水浴。让酶溶液在37°C下重新加热。
将温热的玻片转移到酶溶液中20分钟,然后取出并将其放在冷的家用供水中3分钟。现在您可以继续进行免疫染色方案了。
糜蛋白酶在本协议中具有特征,但可以使用任何酶,只需确保相应地调整Vmax温度和pH值,pH值7.8和37°C为糜蛋白酶的pH值。在超纯水中预加热载玻片可避免将酶溶液置于其中时降低酶溶液的温度。确保新鲜配制酶溶液并立即使用,因为任何延迟都可能影响其蛋白水解特性。同样,在引入载玻片之前,确保酶溶液达到其Vmax温度。与热诱导抗原提取一样,不到20分钟可能会导致抗原提取不足,超过20分钟可能导致抗原提取过度,这可能导致错误或背景染色,并可能增加切片与载玻片的分离。因此,建议再次优化,在免疫化学染色前将载玻片恢复到5、10、15、20和25分钟。最重要的是,请遵守您使用的任何化学品的健康和安全指南。
我们现在已经完成了方案中的第一步,我们将继续进行第二步,这是在含有洗涤剂的缓冲液中进行的许多清洗的第一步。关于缓冲区的一个常见问题是,通常最好使用什么?嗯,再说一次,没有一个通用缓冲区;你必须根据你的实验设计参数使用一个最合适的。作为一个粗略的指南,我个人建议含有0.5%Triton X-100的TBS用于组织切片,含有0.1%Tween的PBS用于细胞学制备。TBS的离子强度高于PBS;因此,TBS有助于提供更清晰的背景染色,但显然不适合细胞学标本,因为它可以渗透性地导致细胞溶解。
洗涤剂,或者更具体地说,在这种情况下,表面活性剂,如吐温和Triton,通过去除细胞膜上的脂质来提高抗体的渗透性,从而使其渗透。大多数抗原的证明当然得益于缓冲液中存在的洗涤剂,但请注意,一些细胞膜蛋白可能会使用洗涤剂剥离,因此在这种情况下最好将其释放出来。洗涤剂可以降低表面张力,帮助试剂在标本上扩散,也被认为可以溶解冰冻切片中的Fc受体,减少背景染色。
Triton比Tween更具攻击性,这使得Tween更加适合细胞学标本,因为它们往往更易碎。我发现,在用于细胞学准备的缓冲液中添加0.1%吐温可以使其更温和地渗透到大多数抗原中。
如果需要更严格的渗透性,可以在方案步骤1和步骤2之间在4 mM脱氧胆酸钠中培养10分钟,在步骤2之前进行额外的缓冲液清洗。如前所述,洗涤剂的浓度也可以简单地增加,但要注意潜在的负面影响。顺便说一句,如果你使用的是磷酸酶标签,请避免在PBS中添加,因为缓冲液中的磷酸盐会抑制它。
在第一次清洗之后,我们现在进入阻塞步骤。阻挡缓冲区有助于防止不必要的背景染色,这可能掩盖阳性染色,或导致假阳性结果。这是通过在含有洗涤剂、10%正常血清、1%牛血清白蛋白和0.3 M甘氨酸的缓冲液中在室温下培养2小时来实现的。使用来自用于培养二级抗体的物种的正常血清。标本中任何与二级抗体有亲和力的内源性免疫球蛋白都会被血清中的免疫球蛋白预先吸附。BSA通过饱和任何将与其他蛋白质(如抗体)非特异性反应的蛋白质来达到类似的目的。在醛固定的标本中,甘氨酸与任何游离醛基团结合,降低疏水性蛋白质相互作用的发生率。
此幻灯片上的图像显示了使用错误血清时可能发生的情况。它所针对的同一种次生生物的血清已被用于与次生生物所针对的相同物种的血清相对应的用途。因此,一种红色的二级抗体非特异性地结合在整个标本上。
我们现在已经进行了阻断,在另一个清洗步骤之后,我们将继续添加一级抗体。将一级抗体应用于样本,在含有洗涤剂和1%牛血清白蛋白的缓冲液中进行最佳稀释。一级抗体将针对其所针对的表位。确保一级抗体与标本的一级抗体不同,以减少二级抗体与内源性免疫球蛋白结合的背景染色。在使用细胞学标本时,这并不是一个真正的问题,除非你用B细胞系染色细胞,这是不太可能的,因为它们本质上是非粘附的。
一旦将一级抗体添加到样本中,下一步是在4°C下培养一夜。亲和力较低的抗体在过夜培养中有更多的时间结合。过度结合不是问题,因为一旦抗原饱和,就不会发生进一步的结合。降低温度有助于通过增加反应时间和降低非特异性蛋白质相互作用的发生率来减少背景染色。通过从轨道振动筛中轻轻搅拌样品,可以增强这种效果。隔夜孵化通常不是必需的,但具有上述优点。希望您已经完成了关于最佳一级抗体稀释度的优化实验。
毕竟,恭喜你!第一天结束了。是时候回家放松一下,全身心投入第二天的训练。我们的主要抗体已经孵育了一夜,现在我们回到实验室进行第二天的免疫染色方案。首先,再次清洗载玻片,去除一级抗体,然后再阻断内源性过氧化物酶;如果我们使用的是过氧化物酶报告标签,那就是。如果没有,你只需跳过第二步和第三步,直接进入第四步。
阻断内源性过氧化物酶仅适用于使用辣根过氧化物酶或HRP报告标记的检测系统。红细胞含有内源性过氧化物酶,如果不用过氧化氢熄灭,它会与过氧化物酶报告标签旁边的色原发生反应,产生假阳性染色。将石蜡包埋标本置于含有表面活性剂的1.6%过氧化氢缓冲液中,在室温下培养30分钟,或在细胞学准备的冰冻切片中培养5分钟,可充分阻断内源性过氧化物酶活性,而不会对组织表位产生不利影响。这就是为什么内源性过氧化物酶淬灭在一级抗体结合后进行,以确保这不是一个问题。你应该只使用新鲜的过氧化氢,因为它在室温下会迅速分解成水和氧气,使其在淬火时失效。最好在使用前将过氧化氢冷冻并解冻保存。此外,当对组织(如脾脏)进行高内源性过氧化物酶染色时,有时最好使用非过氧化物酶报告标签,即碱性磷酸酶或AP。内源性磷酸酶的猝灭将在后面讨论。
下一步——第四步——是开始用选定的检测系统培养样本。该方案重点关注三种常见的系统:直接报告标记的一级抗体、生物素化的二级抗体,如果是ABC、亲和素-生物素复合物或二级抗体报告标记的葡聚糖聚合物或致密聚合物复合物。我在上一次网络研讨会中讨论了这些系统的工作原理和信号放大的主题,包括每个系统的优缺点,所以我不打算在这里详细讨论,但您可以在Abcam博客上查看。
请注意,如果使用ABC系统,将有一个额外的步骤——第六步——稍后我将更详细地讨论,其中添加了实际的ABC复合体。因此,在这个阶段——第四步——只添加生物素化的二级抗体。通常,确保所有检测系统试剂在含有表面活性剂的缓冲液中得到最佳稀释,再加上1%的BSA,并在室温下在样品上培养1小时。
这是一个讨论是使用酶报告标签还是荧光标签的尖锐地方?一个非常常见的两难选择是在特定实验中使用荧光或酶报告标签。酶报告标记物通常用于组织切片,荧光报告标记物通常用于冷冻组织切片和细胞学制剂。然而,这并不是绝对的;检测系统应适合免疫染色实验。荧光优于酶的主要优点是,所有的荧光通道都可以很容易地被分开查看,然后合并形成伪彩色图像。因此,在没有任何专门的光谱或混合软件的情况下,很容易看到荧光反染剂和检测系统之间的信号共定位。也可以孤立地观察到来自初级抗体的微弱信号,而不受其他信号的任何干扰。
由于某些组织成分(如胶原蛋白)具有天然荧光,因此组织切片通常显示自体荧光。甲醛固定也会增加自身荧光的程度。如果强度足够大,它可以屏蔽荧光报告标签的信号,使结果难以解释。因此,酶检测更适合组织切片。细胞学制剂和冰冻切片通常在甲醛中暴露足够长的时间,从而加剧自身荧光,而细胞学制剂通常不具备这种天然荧光成分。
我们的检测系统现在培养1小时,我们将用缓冲液冲洗干净。如果我们使用ABC系统,它将在这个阶段孵化在标本上。按照制造商的说明进行组装。ABC系统用于单独提供亲和素,并在单独的容器中提供生物素标签复合物。最终用户必须将两者进行相应的混合,并等待至少30分钟以形成复合物,然后再将其添加到样本中,否则它将无法发挥检测试剂的全部功能。然而,如果你没有使用ABC系统,你可以跳过第六步和第七步,直接进入第八步。
如果您使用的是酶报告标签,现在可以添加色原了。报告者标签是酶性质的,当暴露于合适的色原时,会为一级抗体结合位点产生稳定的有色沉淀物。其中,免疫化学最常用的两种酶标记是辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。其中每一种都有常用的显色剂,即AEC、DAB和DAB,它们含有HRP所需的镍;AP的固蓝、固红和新品红。从表中可以看出,不同的酶和发色团组合在抗体结合位点产生不同颜色的沉淀。还要注意的是,一些沉淀剂是醇溶性的,这在安装时具有重要意义,我稍后将谈到。
确保所有的色素都是按照制造商的说明配制的,并按照制造商的指南在样本上培养它们。通常,对于DAB,在室温下10分钟通常会产生良好的效果。始终遵守色原有效期作为储存条件。HRP和过氧化氢在DAB显色剂存在下形成络合物,HRP催化过氧化氢分解为水和氧。DAB在此过程中被氧化,并提供电子来驱动反应。正是被氧化的DAB形成了黑色/棕色沉淀物到反应地点。因此,过氧化氢在这一反应中起着关键作用,并且由于它在室温下迅速分解为水和氧气,因此超过有效期的DAB试剂盒可能无效。对于任何实验室试剂的储存、使用、处理和处置,应遵守适当的COSHH指南。如果使用碱性磷酸酶报告标签,则向工作色原溶液中添加0.24 mg/mL左旋咪唑。左旋咪唑抑制内源性磷酸酶活性,减少不必要的背景染色,尽管在胎盘或小肠中没有。别担心,磷酸酶报告标签本身不会受到左旋咪唑的影响。
在冲洗完色原和自来水后,我们现在可以进行适当的复染。反染色通过对某些细胞结构进行染色来增加与颜色相关的细胞或组织,从而帮助确定免疫染色的位置。它们在性质上可以是酊剂或荧光剂,在用于可视化初级抗体的切片系统中是互补的。对于酶检测系统,通常使用染色和核复染。我将在本次网络研讨会的第二部分详细讨论荧光染色。
使用酶染色检测系统时,最常见的核反染色是苏木精。根据所用媒染剂的类型以及它们是渐进性还是退化性染色,可以在许多配方中获得苏木精。根据使用的类型,苏木精可将细胞核染成各种深浅的紫色或蓝色。血红素,特别是它的氧化产物,血红素是一种离子,因此对DNA几乎没有亲和力。媒染剂是与血红素结合的铁盐,能产生带正电的染色剂络合物,并能结合离子色素。明矾或铝媒染剂可逐步或逐步使用。
例如,渐进性苏木精是迈耶氏、吉尔氏或卡拉齐氏的,可以应用于组织或细胞,直到观察到所需的核染色程度。将渐进性苏木精(如Harris’s)涂敷于组织,直到观察到过度染色,然后通过浸泡在酸中(如1%的酸性酒精)去除一定比例的过度染色。这个过程叫做分化。由于分化步骤的释放,以及与醇溶性酶、底物最终产物(如HRP和AEC反应产生的底物)的亚序列兼容性,这使得进行性血毒毒素更易于使用和倒退。
所有进行性和退行性苏木精都是蓝色的,达到了预期的染色水平。在酸性条件下,苏木精将细胞核染成红色,但在碱性环境下,苏木精会变成令人愉悦的蓝色/紫色。生活用水、供水通常用于此目的。它通常具有足够的碱度来实现这一点,特别是在硬水区。在软水区,可以使用碱性溶液进行发蓝,例如0.05%氨水。
其他常用的着色核反染剂有浅绿色、坚牢红色、甲苯胺蓝和亚甲基蓝;然后在细胞核中分别是绿色、红色或蓝色。使用核着色复染时的一个重要注意事项是,如果您正在展示核抗原,不要使染色过于强烈,因为复染可能会掩盖来自检测系统的阳性信号。
现在我们来讨论显微镜分析的样品制备。制备免疫染色标本至关重要,以便在长期保存期间对其进行成像,并提高图像质量。这通常包括在试样上放置玻璃盖玻片,用一种称为安装介质的合适粘合剂将其固定到位。安装介质可以是水性的,适用于荧光和酶标记,也可以是有机的,仅适用于酶标记。有机安装介质往往会变硬,使玻璃盖滑片能够安全地保持在原位。
有机安装介质(如DPX)的折射率更好,可以在显微镜上获得更清晰的图像。然而,确保酶标与底物反应形成的颜色沉淀物与有机贴装介质兼容。例如,过氧化物酶和AEC的反应是醇溶性的,因此如果使用有机固定介质,则在脱水和清洁过程中会消失。
荧光标签需要水性安装介质;可以使用10%的甘油,但含有防褪色试剂的市售培养基效果更佳。使用荧光标签时,建议在显微镜下观察空白盖玻片上的安装介质,以确保其不会产生任何自动荧光。我很高兴地说,我们的免疫染色标本现在可以在显微镜下进行分析了。显微镜分析本身就是一个完整的网络研讨会,特别是探讨如何与光学显微镜和荧光相比建立显微镜最佳照明;所以我现在不想谈这个。
现在让我们考虑多重染色。使用多个报告标签进行免疫染色的目的是同时可视化同一细胞或组织切片中两个或多个抗原的细胞定位。每个抗原使用不同的报告标签,以区分它们。抗原可能是共定位的,即在任何给定细胞的同一细胞隔室内,也可能是分离的。
当两种或多种抗原共同定位时,单独的报告标记的颜色将混合产生新的颜色。荧光和酶报告标签都可以使用,但需要仔细选择,以确保它们不会相互干扰,并且容易相互区分。同样,检测系统试剂不得以任何方式相互交叉反应或干扰。本次网络研讨会将集中于荧光多训练,这样以后总是有可能再单独举办一次酶的网络研讨会。
在继续之前,我们将首先考虑荧光是如何工作的。荧光分子能够吸收特定波长的光,并以更长的波长重新发射光。在荧光发射之前,它通过与环境相互作用而损失能量;一种称为内部转换的现象,即在没有光发射的情况下能量的损失。
电子可以以基态或静止态(称为S0)存在,也可以以高能激发态(称之为S1和S2)存在。在这些电子态中的每一种,荧光色素都可以以许多振动能级存在,称为0、1和2。室温下没有足够的能量来填充S1和S2的激发电子态,或基态的更高振动能级。因此,吸收通常发生在处于最低振动能量状态的分子中,并且仅在光存在的情况下发生。
在吸收之后,荧光色素通常被激发到更高的振动水平,成为S1或S2,然后放松到S1的最低振动水平,从而完成内部转换过程。再加上光子的发射,就产生了荧光。荧光色素可以在激发漂白荧光信号之前多次重复激发发射循环,也称为光漂白。然而,一些荧光团比其他荧光团更容易漂白。例如,FITC可以在发生光漂白之前重复大约30000次激发-发射过程。然而,第二代荧光染料,如Alexa Fluor®正如这张幻灯片上的图片所示,范围不会像光漂白那样迅速,而且通常会更亮,因为它们具有更高的消光系数,因此更适合进行多标记实验。
考虑到这一点,我们现在将讨论如何为多重染色实验选择荧光报告标签的组合。除非有合适的光谱或混合软件,否则必须选择荧光色素,以使其发射光谱不重叠。这一点很关键,否则一个荧光团的发射可能会在用于另一荧光团的滤波器组中检测到。这种现象被称为“穿流”、“串扰”或“交叉”。由于许多荧光团的非对称光谱特性以及相关的宽带宽,会发生漏光。
考虑Alexa Fluor的同时光谱发射分析®488和Alexa Fluor®右下角图像中的555。最大发射峰值似乎定义明确且相互分离,但Alexa Fluor的最大发射峰值®555与Alexa Fluor仍有显著重叠®这会导致Alexa Fluor渗出®488进入Alexa Fluor®555通道。在右上角的Cy3图像中可以看到同样的现象®渗入Texas Red®。
因此,目的是通过使用另一个具有足够长发射波长的荧光团来最小化或消除重叠,从而最小化发射重叠的面积。如果Alexa Fluor®使用594替代Alexa Fluor®555,Alexa Fluor的渗透效应®由于Alexa Fluor的发射曲线,488将足够小,可以在多标签实验中同时使用这两种染料®594位于Alexa Fluor的右侧®488比Alexa Fluor®555,因为发射重叠的面积较小。
这就是为什么使用来自不同光谱区域的一个荧光团的三色或四色荧光如此流行的原因。由于吸收光谱和发射光谱之间的距离足够远,不允许或很少允许渗出。例如,DAPI代表蓝色,FITC代表绿色,TRITC代表黄色和Cy5的传统染料组合®因为红色是常用的。与此等效的第二代染料组合是蓝色的DAPI,Alexa Fluor®488代表绿色,Alexa Fluor®黄色和Alexa Fluor为555®647代表红色。
值得一提的是,在这个阶段,并不是每个荧光信号都需要来自缀合的抗体。它可能来自DAPI等核反染,也可能来自MitoTracker等细胞器特异性染色,或来自与荧光标记结合的小麦胚芽凝集素等细胞膜反染。精心选择的显微镜吸收和发射过滤器可以大大减少渗出。事实上,它是显微镜使用上的一个过滤器,最终将决定可以成功使用的荧光团。
在设计使用荧光报告标签的多标记实验时,可以采取几个步骤来帮助减少或消除渗出。首先,使用光谱分析仪程序观察潜在荧光团的吸收光谱和发射光谱,以及显微镜过滤器的特性,以评估可能的兼容性问题。尽量使用发射特性尽可能窄的荧光团,以尽量减少与波长较长的其他荧光团的重叠。为荧光团染色含量最少的蛋白质,量子产率最高。如果预计两种或两种以上的蛋白质的丰度相似,则尝试降低波长最短的荧光团的浓度,以减少渗入波长较长的荧光团中的程度。仔细平衡显微镜的滤光片组,以尽可能接近每个荧光团的光谱吸收和发射曲线。
平衡显微镜的曝光和中性密度过滤器设置,以微调过度侵蚀的荧光信号。最后,在进行实际的媒染剂染色实验之前,使用其他荧光团的过滤器组在原位分别观察每个荧光团,以实际评估任何溢出问题。如有必要,在上述参数范围内调整实验设计。
虽然这次网络研讨会的重点不是使用酶报告标签进行多重免疫染色,但我认为简单比较酶和荧光是一个好主意。正如我们一直在讨论的那样,荧光有多种可用的报告标签,长期以来被证明是极其敏感的,每个标签都可以相对容易地单独观察到。然而,与酶相比,它有几个缺点。首先,当荧光信号彼此接近时,由于能量从激发的荧光信号转移到另一个荧光信号,从而使共振能量转移发生转变,从而使荧光信号猝灭。其次,荧光信号在存储或分析过程中可能会发生褪色或光漂白。最后,样品自身荧光因醛固定而加剧,可能会干扰结果的解释。
酶和色原的组合允许使用两种或两种以上的最终产品沉淀颜色,从而消除与荧光有关的问题。此外,由于有色沉淀物独立于检测系统定位在组织上,这允许通过热诱导表位检索洗脱初级和检测系统抗体,从而允许后续的免疫染色,而无需担心不必要的抗体交叉反应。对于荧光和酶显色产物,光谱分解软件的发展允许分离信号,即使在人眼无法区分共同定位的情况下,也允许使用多种不同的标签。
现在我们来讨论实际的多重免疫染色技术。简单地说,多重染色实验是两种或两种以上单个标记染色技术的组合。本次网络研讨会前半部分讨论的方案是制定多训练方案的良好基础,以便在适当的情况下寻找清洗步骤的必要培养。强烈建议在所有情况下使用高度交叉吸附或预吸附的二级抗体,以帮助将交叉反应性降至最低。强烈建议在将它们组合到多标记实验中之前,对每种单独标记技术的特定浓度等进行优化。主要关注的是如何避免每个单独检测系统的单个组件发生交叉反应。
多种染色技术本身可以分为两组:同时,将主要抗体一起应用,然后使用切片系统;和顺序,其中一个单标记染色技术在另一个之前完成。
我们首先来看一下同步染色。如果用于产生初级抗体的物种在系统发育上有足够的差异,那么它们可以一起应用于标本。在小鼠和兔子中培育的一级抗体组合在系统发育上有足够的差异,而在小鼠和大鼠中培育的组合则不会。在同一物种中产生的针对那些携带不同荧光团的物种的二级抗体可以同时使用。使用在没有足够系统发育差异的物种中培养的一级抗体也可以实现同步染色,如果抗体直接用不同的荧光标签标记每个一级抗体,甚至可以培养相同的物种。当然,只有当所有抗原都非常丰富并且需要低程度的信号放大时,这才是可行的。如果同一物种中产生的一级抗体具有不同的等型,并且使用了等型特异性二级抗体,则可以使用这些抗体进行同步染色。正如你所看到的,同步染色的方法非常有限,特别是在信号放大方面,顺序染色更为有利。
顺序染色比同时染色更灵活,可以进行额外的信号扩增,而不仅仅是二次抗体,用于低丰度抗原。最敏感的检测系统应该保留给预期含量最低的抗原。需要特别注意试剂的添加顺序。例如,三种主要抗体全部在小鼠体内产生:一种直接与荧光团结合,一种直接结合生物素,另一种结合。
第一步:将样品与未结合的小鼠原代培养。
第二步:将标本与荧光标记的次级,如山羊抗鼠孵育。
接下来,用小鼠血清培养样本,以确保山羊抗鼠抗体饱和。
第四步:将标本与生物素化的小鼠原代培养。
第五步:我们将用荧光标记的ABC复合物培养样本。
最后,第六步:将样品与直接荧光结合的小鼠抗体孵育。
这将导致三色染色,而试剂不可能发生交叉反应。还请注意,在上述顺序中的每个步骤之间都将进行缓冲洗涤。当使用同一物种中产生的抗体时,另一种方法是通过添加某种桥联抗体从技术上改变一种主要抗体的物种。例如,两种主要抗体,都是在小鼠体内产生的:一种是结合抗体,另一种是直接结合HRP抗体。
第一步:将标本与第一只未结合的小鼠原代培养。
第四步:然后用第二个HRP结合的小鼠原代培养样本。
第五步:我们将标本与抗HRP抗体孵育,例如兔抗HRP。
最后,第六步:将样本与荧光团结合的山羊抗兔抗体孵育。
或者,直接生物素化的第二种小鼠抗体和使用的ABC系统。同样,请注意,在上述顺序的每个步骤之间都会有缓冲清洗。
最后,让我们考虑在进行多重免疫染色时必须采用的控制措施。与所有免疫染色技术一样,控制对于验证任何染色都是真实的结果,而不是检测系统或标本的固有特性至关重要。由于多重染色是两种或两种以上单独的单标签染色技术的组合,因此每个检测系统可以使用的单独试剂控制的数量可能会相当大,特别是考虑到现代实验室的时间限制。至少应做到以下几点。首先,阳性对照组对每个一级抗体和检测系统组合进行单独的单一染色技术。最后,阴性试剂对照对每个检测系统进行单独的单一染色技术,减去初级抗体。
我的这部分网络研讨会快结束了,但关于多重免疫染色,如果你什么都不记得的话,请记住以下几点。只要仔细注意实验设计,就可以进行多种染色组合。选择荧光灯,使其发射光谱不重叠,并将其与显微镜上的过滤器匹配。仔细考虑各种可用的检测系统、潜在的交叉反应性和试剂的添加顺序。最后,始终使用适当的对照品,并隔离执行每种单独的染色技术,以优化每种试剂的浓度并评估潜在的渗出。
非常感谢您抽出时间,我希望您觉得它很有用。我会在几分钟后回来回答你的一些问题,但同时请你回答朱迪思。
J: 感谢Simon为您举办如此详细的研讨会,再次向您问好。我想借此机会告诉您更多有关Abcam的IHC/ICC资源和产品的信息,这些资源和产品将帮助您改进细胞成像实验。兔单克隆抗体(RabMAbs)具有较高的亲和力和特异性,因此具有较高的敏感性和较低的背景染色。这使它们成为在苛刻的应用中使用的理想试剂,例如在福尔马林固定或石蜡包埋组织上的IHC。RabMAb已在多个人体组织阵列上进行了IHC测试,或在多个样本上进行了ICC/IF测试的最佳经验。RabMAbs还提供了对人类蛋白靶点和小鼠直系物的不同表位识别,因此无需生成单独的替代抗体。由于它们是兔子的后代,因此非常适合用于小鼠或红组织样本。它也可以很容易地与小鼠或大鼠单克隆抗体配对,以便同时染色。有关更多信息,请访问abcam.com/RabMAbs。
对于RabMAb的染色,我们建议您使用我们最近发布的Alexa Fluor®结合二级抗体。这些抗体可与Alexa Fluor结合®488、555、594和647。所有这些二级抗体都已在Abcam实验室进行了广泛测试,以确保明亮的染色和低背景。预吸附抗体的选择范围很大,以确保这些物种的交叉反应性。所有产品的稀释范围在1/200到1/1000之间,大约需要250次染色。除此之外,所有产品的价格都很有竞争力。有关更多信息,请访问abcam.com/Alexa。
Abcam的目录包括一系列用于多色染色的细胞成像工具。探索我们的CytoPainter系列试剂盒,用于多种颜色的肌动蛋白丝、线粒体和溶酶体染色。这是一种研究共同定位的简单方法,而无需处理多个抗体。CytoPainter试剂盒可与次级抗体和核染料结合使用。右上角显示的小鼠类胚体IHC图像就是一个例子。
对于细胞核的无麻烦染色,为什么不试试五分钟内就能显示细胞核染色的远红色染料呢。该范围包括DRAQ5和DRAQ7,可用于染色活细胞或固定细胞。细胞核的底部图像用DRAQ7染色,蓝色染色来源于AMCA结合的次级抗体。
我们有广泛的经验证的细胞成像二级抗体组合,包括我们的预吸附Alexa和透析共轭二级抗体,以实现最小交叉反应。我们的产品范围还包括用于阶梯显微镜的铬共轭二级抗体和用于高分辨率电子显微镜的AbGold共轭二级血清。为了在您的IHC实验中增加组织渗透,我们建议您尝试我们的F(ab’)2抗体。
对于非荧光成像和酶检测,Abcam还为IHC提供了一系列全面的产品。产品组合中包括EXPOSE IHC试剂盒,与聚合物和ABC检测系统相比,该试剂盒具有更高的灵敏度。这是通过较小的检测复合体实现的。除了各种试剂外,我们的IHC产品组合还包括经典的生物素和链霉亲和素试剂盒。如果您想了解更多有关我们的细胞成像产品的信息,请访问abcam.com/imaging。在此页面上,您可以找到更多详细信息,并可以放大一些图像。
使用小鼠抗体和小鼠组织时经常遇到的一个并发症是高水平的背景。这是由于二级抗体结合内源性小鼠IgG所致。我们提供的一种解决方案是鼠标对鼠标IHC检测套件。这种基于聚合物的检测试剂盒包含一种阻断试剂,用于阻断内源性小鼠IgG,除了简单可靠的方案外,还确保了最低背景。有关此产品的更多信息,请访问abcam.com/MoM。
正如西蒙在网络研讨会上提到的,防止光漂白很重要。为此,Abcam提供了一系列荧光屏蔽安装试剂。这些都可以与或不与核染料,如DAPI和碘化丙啶。Abcam科学支持团队将为您解答任何问题。团队成员使用多种语言,并提供多种语言支持,包括法语、西班牙语、德语、汉语和日语。你可以在美国、英国、香港和日本联系他们。
在Abcam网站上,你可以找到各种免费资源和协议。您可能感兴趣的是新的IHC应用程序和“了解二级抗体”指南。后者解释了何时使用F(ab')2多重染色实验中的片段和预先吸附的二级抗体。
此外,我想强调一下我们未来的网络研讨会。如果您能在3月21日加入我们的在线研讨会,我们将非常高兴高级免疫沉淀本次网络研讨会将由Abcam的Sean Garry博士和Rachel Imoberdorf博士主持。它提供了大量实际操作建议和故障排除技巧,以改进您的IP实验。我们将于4月10日为讲西班牙语的观众举办一场西方吸食法介绍网络研讨会。您也可以通过以下方式收听我们过去的所有网络研讨会,包括西蒙最近关于设计IHC/ICC实验的网络研讨会abcam.com/网络研讨会.
为了感谢您参加此次网络研讨会,我们想为您提供所有次级抗体、细胞涂料试剂盒、IHC试剂盒、亲和素和链霉亲和素以及RabMAbs的25%特别折扣。要利用此优惠,您只需在下单时引用促销代码ICCTBDYY。最后,我要感谢西蒙和你们所有人的出席,并祝你们在未来的IHC-ICC实验中一切顺利。
SR:谢谢你,朱迪思。与第一次网络研讨会一样,我们提出了一些非常好的问题。由于时间限制,我只能完成其中的三个,所以我选了三个非常好的。凯文问:我在多标签实验中有很高的背景。为什么会这样?好吧,这可能是由于很多原因,凯文,比如过度提取抗原,可能会尝试更少的提取时间,不同的缓冲液,更多的酶。阻塞不足,阻塞时间太短,或者使用了错误的血清。你的组织可能富含内源性酶,或者它们还没有被充分淬灭。如果使用ABC检测系统,组织也可能富含内源性生物素。还有什么?物种交叉反应性,因此检测试剂可能是交叉反应的,或者二级试剂可能只是与封闭血清中的免疫球蛋白结合。也许你想尝试使用预先吸附的二次离子以获得额外的特异性。您使用的抗体可能不适合IHC或IF,或者通常只是非特异性的,并且您的标本中也可能存在高水平的自体荧光。我不知道你的确切实验设计。
实际上,现在还有很多其他的可能性还远远不能涵盖,但如果我是你,我会逐行检查你的所有协议,看看你是否能识别出上述任何可能性。不要忘了为每一个正在使用的单一染色程序提供所有必要的控制,并单独执行每一个程序。这很可能是你的背景染色来源的关键。无论如何,祝你好运!
另一个问题。Mandy说:我正在使用驴血清进行二次阻断和抗羊,我的背景很高,你有什么建议吗?好吧,最显而易见的是,即使你的二级抗体是针对羊免疫球蛋白的,它也在一定程度上检测驴子。这一切都与系统发育有关,所以驴和羊都是有蹄类动物——如果我错了,请纠正我——因此,免疫测定序列和免疫球蛋白重链将非常相似,因此,存在交叉反应的可能性。
我想你可以做几件事。第一,你可以用一种预先吸附在驴身上的防滑物,看看是否有什么不同。或者你根本不能用驴血清来阻断,完全忽略它,看看问题是否解决。或者,我想,你也可以看看你是否能找到一种针对你的抗原的初级抗体,这种抗体不是在羊身上培育的;所以如果你使用另一个次要的。例如,试着找一只老鼠或兔子做主食,然后用山羊做副食。试试看是否有用。
我们还有时间再做一个,最后一个是史蒂文写的,他想知道:你提到了光谱或混合软件,你能告诉我们更多有关这方面的信息吗?说实话,史蒂文,我自己并没有太多实际使用它的经验,但我参加过几次讲座,人们对它印象深刻,并展示了他们在实践中取得的一些好成绩。相信我,如果我控制了部门的预算,我明天就会买一个。所以,简而言之,这是一款对颜色比人眼更敏感的显微镜软件。换句话说,它可以区分标签中非常细微的颜色差异,特别是当它们在联合定位实验中合并时,可以更容易地分离和可视化信号。因此,让我们使用光谱上重叠显色产物和最终产物的报告标签,以及荧光标签,允许在多标签实验中使用额外的标签,否则您无法用肉眼区分。如果你有多余的钱,这钱很值得。正如我所说的,由于时间限制,这些问题是我唯一能回答的问题,但也是很好的问题。非常感谢你。露西,请你把事情总结一下。
LP:谢谢西蒙和朱迪思。正如Simon所提到的,不幸的是,我们已经没有时间了,我们还无法回答所有收到的问题,但对于那些尚未回答问题的人,我们的科学支持团队将很快与您联系并给出答复。此外,我们还收到了一些关于人们在哪里可以找到演示幻灯片副本的问题。当您从现场网络研讨会注销时,您将被重定向到一个可以下载PDF的网页,并且您还可以找到有关网络研讨会促销的更多信息。如果您对我们在此次网络研讨会中讨论的内容有任何疑问或有任何技术问题,请随时联系我们的科学支持小组他很乐意帮助你。可以通过以下地址联系他们technical@abcam.com最后,我们希望您喜欢这次网络研讨会,并发现它对您的工作有用,我们希望欢迎您在未来参加另一次网络研讨会。再次感谢您的参与,祝您研究顺利。
*我们很遗憾,本次会议期间提到的合作伙伴网络研讨会“优化您的IHC和ICC结果”不再可用,因为它不符合我们当前的质量标准。我们希望在未来提供更多的IHC/ICC网络研讨会,但您可以在我们的完整的IHC指南或我们的免费按需IHC培训.