荧光免疫印迹网络研讨会

观看伦敦大学国王学院Martin Broadstock博士的点播网络研讨会

回顾这一流行和强大的方法,准确地检测低丰度蛋白质或蛋白质表达的变化。

这个研讨会是为那些想了解并将更灵敏的荧光检测方法纳入他们的Western blot协议的科学家们设计的。

看网络研讨会

网络研讨会主题:

  • 荧光蛋白印迹法简介
  • 荧光蛋白印迹技术在研究中的应用
  • 荧光检测的应用
  • 荧光与化学发光的优点
  • 荧光应用中的挑战和常见缺陷
  • 荧光蛋白印迹技术的发展趋势

主持人:

Martin Broadstock博士目前是伦敦国王学院的爱德蒙和莉莉萨弗拉研究员。

在过去的十年里,他从事生物医学研究,在那里他研究了治疗帕金森氏痴呆的新疗法。·


网络研讨会转录本:

大家好,欢迎来到ABCAM的荧光蛋白印迹的网络研讨会。今天的演讲嘉宾是伦敦国王学院的Martin Broadstock。马丁在过去十年从事生物医学研究,是国王学院的爱德蒙和莉莉萨弗拉研究员。这是他研究治疗帕金森病痴呆的新疗法的地方。·

加入Martin today将是Augustine Mzumara,我们的新产品团队的成员。奥古斯丁在伦敦帝国学院拥有人类分子遗传学硕士学位。在加入ABCAM之前,奥古斯丁曾在葛兰素史克公司担任研究科学家,在分子生物学方面有着丰富的背景。当您从这个网络研讨会注销时,您将被重定向到一个网页,在那里可以找到并下载演示网站的副本。现在我将移交给马丁,他将启动这个网络研讨会。

所以,实际上,我的研究着眼于广泛的神经退行性疾病中的突触功能障碍,并研究治疗方法及其对这些功能障碍的潜在影响。从技术上讲,我经常表演西部片,现在都是荧光。我做了免疫组化和免疫细胞化学,其中大部分是荧光。我也做了一些体内工作,这是我今天不准备讨论的。所以我们要强调的是,在沃尔夫森中心,我们现在已经摆脱了我们的黑暗房间内的建筑,我们都转化为欢乐的荧光蛋白印迹。就像一个示例图像——在右边是一个示例图像,我们已经转换成灰度以便于发布。这些是多路复用的西方人,你从相同的凝胶中得到两张图像,使用的抗体主要来自于ABCAM,这显示了在阿尔茨海默病小鼠模型中的亲氧化性饮食治疗后突触蛋白表达的改变。

现在我们来讨论荧光,以及它与ECL的比较,这是很多人所熟悉的。在运行西部的初始阶段,ECL和荧光没有太大的差异。虽然你通常从你的组织或细胞中提取蛋白质开始,但你的蛋白质总细胞负荷是定量的,我没有在这里展示。一旦你稀释了你所有的样品或者你的体积相同的浓度,或者计算出你的体积来加载到你的凝胶上,你就可以加载和运行你的凝胶。然后,将凝胶转移到膜上,通常是PVDF或硝酸纤维素,阻断非特异性结合,然后与所选择的初级抗体孵育。过了一段时间后,你与二级抗体一起孵育,这两种不同的检测方法开始有所不同。

因此,使用辣根过氧化物酶结合抗体和ECL,你必须建立你的ECL检测试剂。然后你将你的凝胶暴露在胶片上,最后你可以分析你的图像,你可以看到,在左上角显示出一些清晰清晰的东西。然而,用荧光蛋白印迹法,你可以直接从抗体染色直接到图像分析。你可以看到,这是精简工作流程,并让你继续与其他的东西,你已经在实验室。

做荧光蛋白印迹的优点是什么?一个是与HRP和ECL相比可以看到的改进信号。用ECL,信号一般被认为稳定大约半小时,一旦你混合了所有东西,并把它应用到膜上。然而,随着荧光,信号更稳定;事实上,我已经打开了一些膜,并在一年后重新扫描,在量化方面获得了完全相同的结果。膜可以存档的项目正在进行中的实验室,并可能需要独立验证后。ECL有时也会导致较小的重量蛋白质被遮蔽,而荧光允许这些更小的蛋白质更精确地解决。此外,荧光一般显示出改进的灵敏度,因此当与ECL相比时,它们能够检测到更小数量的蛋白质。因此,存在敏感性问题,而且,在当今的融资环境中,用荧光降低成本非常重要。

虽然对于一些扫描仪的初始支出是相当昂贵的,但是如果你的部门经常运行相当数量的西方人,那么切换到荧光检测实际上可能更划算。在这里,你可以摆脱电影和开发者的需要,他们本身并不是廉价物品,开发者也常常是危险的。你也可以消除对暗室的需要,因为现在大多数扫描仪都是台式的,并且可以很容易地被纳入实验室。另外一个关键的节省是抗体的成本;我通常使用从大约1/10000到1/20000的二次稀释,这意味着你的小壶的抗体持续很长的时间,并且这些抗体的支出通常与HRP共轭的一个相同。以印迹为基础的印迹的进一步节省是对分子量标记物的需求的减少,其中许多,即使它们没有被市场化为荧光适合的,一旦扫描后就会出现荧光。事实上,Li-COR网站建议每荧光荧光印迹1.84美元,每个ECL印迹18.39美元而不剥离和重新探测,和27.42美元每ECL印迹与剥离。所以,如果你使用荧光,每花大约20美元或者大约15英镑,这会拯救你。因此,你可以看到,如果你开始每天做100凝胶,你将迅速弥补显著的成本节约。

除了增强的灵敏度和降低的成本之外,另一个主要优点是这种能力在单个膜上同时复用或检测两种蛋白质。例如,你可能想看看磷酸化的蛋白质,并比较这些水平对他们的非磷酸化的同行。然而,使用旧的系统,您可以运行两个ECL凝胶或尝试剥离和重新探索不同的异构体。有荧光,你可以简单地运行一个凝胶,并使用两个不同的原色,和两个交替的荧光二次在相同的凝胶。这样就不会出现剥离和再探的问题,而且样品的传输效率也完全相同。我们经常为我们感兴趣的蛋白质和内务蛋白做这件事,对于我自己来说,它可能是β-III微管蛋白或肌动蛋白,这允许在相同的凝胶上正常、精确地归一化蛋白质。如果你的蛋白质接近大小,剥离和再探索可能会相当棘手,而且如果你对剥离有点敏感,总是有开始从膜本身去除蛋白质的风险。最后一个优势,这是我早些时候逃避的时间,这意味着你可以继续你手头的其他任务。

所以我可能已经开始说服你去荧光了,但是从ECL到荧光的最佳方法是什么?在接下来的两张幻灯片中,我对我们第一次做出改变时遇到的不同问题进行了一些思考。我想提醒大家,请用右下角的问答面板来回答任何问题。你可能遇到的第一个问题是与初级抗体浓度有关。一般来说,根据我的经验,你可能不得不减少它们,因为过多的染色几乎会烧掉一些扫描系统,这会导致检测精度的降低。因此,优化你的抗体浓度,有时小学的罚款,但你可能不得不玩二次,并选择那些稀释,给你一个干净,干净的背景信号。老实说,这可能是最重要的问题,当切换,只需要做一点点的重新优化,一般来说,如果我可以建议,使用较低的浓度。

另一件事是使用低自体荧光膜是非常重要的,否则,你将在信号和噪声的检测和量化的频带中挣扎。许多供应商实际上在其膜上表现出低的自体荧光,并且有低荧光PVDF膜可用。然后看看你的阻塞缓冲器,所以与ECL相同,不同的阻断缓冲器可以给你不同的效果,特别是对初级抗体。我通常在PBS TWEN中使用5%脱脂牛奶。

在缓冲液的主题上,确保你选择的缓冲液完全溶解,溶液中没有微粒。这些粒子可以沉淀在你的膜上,并产生荧光假象,如果他们这样做的话。而且,有趣的是,BILO标记往往具有一些自体荧光能力,有时可能会发生,当然它们已经被涂抹了。所以,如果他们现在使用,也许试着用铅笔代替。不要对膜施加太大的压力,因为锋利的物体有时也会留下荧光制品。所以试着用钝钳处理它们。

特别是,在荧光方面,所使用的主要抗体是相对光稳定的,并且它们不会在正常实验室照明中褪色。虽然,我必须承认,我倾向于把我的膜培养在黑暗中,因为旧习惯很难消亡。然而,我总是把箔纸包裹在我的抗体库上,并把它们放在一个防光盒里,以避免任何潜在的光漂白。

当处理膜时,总是使用无粉手套,否则你会在污点上形成一个带有荧光指纹的杂乱膜,所以不难看出谁是罪魁祸首!

我倾向于避免剥离和重新探测我的荧光膜,这是绝对诚实的。通过多路复用,我已经使用内部控制对总蛋白质进行了核算。我发现对非常高丰度蛋白质的抗体很难从膜中除去,而不影响膜的其他区域的总蛋白质。对于较小的丰富的蛋白质,它可以做到,并且有许多配方在线和专有的解决方案可供一系列供应商。就像我说的,这是我们之前做的一种小而丰富的蛋白质。

最后,如果你要在你的染料中使用溴酚蓝,我建议你确保你的染料前面已经足够远离预期的蛋白质大小,因为这种染料有荧光的倾向。话虽如此,我总是在所有样品中使用,但我发现通过改变凝胶百分比,我能够确保染料前线已经通过了我感兴趣的领域。

现在,我已经谈到了多路复用,这里有几个指针,希望能帮助你最大程度地利用这一激动人心的进展。这听起来很明显,但值得指出的是,如果你想要复用,你就需要使用来自不同物种的初选。同样值得考虑的是,你可能想要使用与老鼠和大鼠不相关的物种的初选,因为这些抗体有相互作用的倾向。我建议你使用二次抗体,它们是高度交叉吸附的,它们可以防止通道互相出血。使用具有明显和不重叠光谱的荧光染料。作为一个一般的经验法则,我也会在使用多重抗体之前相互独立地优化每种抗体。这样你就可以验证你的两种抗体,因为有时候抗体会给你二次非特异信号,如果你试图多路复用,你试图看到一个特定的信号,可能是这个特定的信号被另一抗体的非特异性信号掩盖。

因此,能够在Western印迹中进行多重化是非常有用的,但是我认为荧光的未来是什么?从某种意义上说,这些技术已经在今天使用和使用,并且在没有水晶球或任何其他未来占卜的方法的情况下,我想我会简单地提到这些,因为它们比目前使用的方法有一些特殊的优势。凝胶中的西方正是它所说的:在这里,你把转移步骤完全转移到硝酸纤维素膜上,相反,你直接用抗体染色凝胶。这使得它对于非常大的蛋白质来说是理想的,即使在相同的凝胶上不损失较小的蛋白质,也常常难以有效地转移。你去除阻塞步骤,然后直接使用初级和次级直接进入凝胶本身。许多人发现这种敏感性足以使用,就像我说的,特别是那些难以转移的蛋白质。然而,直接处理凝胶可能有点麻烦,而且通过处理凝胶会产生眼泪,通常,在我的经验中,总是在错误的地方。

另一种选择是完全去除基于凝胶的系统,这可以通过使用ON或细胞内的西部来实现。取决于你的蛋白质定位在哪里,决定它是在细胞上还是在细胞中。从方法上讲,这最类似于进行免疫细胞化学,在那里你修复细胞,渗透膜或不渗透,如果你在看膜结合蛋白添加你的初选,然后添加你随后的次级。我通常这样做,与肌动蛋白结合,以控制不同的威尔斯之间的细胞数目变化。它可以使分析稍微复杂一点,但过程本身节省了大量的时间,通过取消收获,运行凝胶步骤;所以这比弥补它。它也可以用于验证RNAi干扰,并且具有高灵敏度。基本上,如果你的抗体用于免疫染色和西方人,它们对于细胞上或细胞内都可能起作用。

为了可视化你的荧光读数,你显然需要一个成像系统,它可能已经用于你部门中的不同应用程序。系统的两种主要类型:红外系统和非红外系统,IR系统是我最熟悉的系统,这是Li-Cor OdysSee系统。它使用两个激光器在700和800 nm激发荧光染料在红外范围内,其中Li-Cor报告有非常低的自荧光,因为这个红外范围。缺点是,通常不能将你的二次抗体用于其他应用,因为大多数显微镜不会在红外范围内挑出任何东西,尽管在凝胶上和细胞内的西方人是很好的。

或者,您可以使用一个非IR系统,并且有很多这样的可用的许多供应商。现在你的成像系统,我想我会简要回顾四个最常见的陷阱和可能的解决方案,荧光西印迹,即:全球高背景,斑点背景,弱信号和非特异性带。对于ECL或其他检测系统,这些问题中的一些将保持不变,那么它可以被视为优化西部片的通用工具。

所以我试着去思考高背景的可能原因,以及一些技巧和技巧来帮助消除这些原因。高的背景往往是由于阻塞不足,所以我建议这是你的第一个地方看一看。尝试使用替代阻断溶液,无论是牛血清白蛋白还是牛奶。尝试添加一些洗涤剂,如吐温20或SDS,以除去附着在膜上的不需要的蛋白质。优化你的抗体浓度,重要的是,保持膜均匀湿润,并尽量处理它尽可能少。

另一个问题可以是背景中的斑点的出现,而不是背景荧光的全局增加。再次,保持你的膜均匀湿润,清洗扫描仪和过滤你使用的任何阻挡溶液应该有助于控制这个问题。

一个微弱的信号经常遇到印迹,因此,对于这些问题,我建议先增加蛋白质总量加载到凝胶上,然后改变主要浓度之前尝试任何其他步骤,我建议。此外,您可以尝试改变您的二次浓度,我总是建议使用染色后转移,如胭脂红染色检查您的转让效率,也出现可怕的气泡在膜上。如果转移不是问题,你可能需要重新检查你的膜,因为小的蛋白质特别是可以穿过膜,而较大的蛋白质只是开始迁移。我建议,在这种情况下,要么减少传输时间,要么尝试一个较小孔径的膜。

我想解决的最后一个问题是非特定波段。如果在这里独立地观察每种抗体,这里的罪魁祸首往往是太高的初级抗体浓度,或太长的潜伏期。尽量减少初试量,或者尝试在较短的时间内孵育,如果你在室温下做,或者尝试在4°C过夜,我发现这是我的最佳选择。当你使用多个不同的,最好不是密切相关的物种的抗体时。检查你的不同抗体的光谱,以确保没有流血,如果这不起作用,你可以尝试减少蛋白质总量加载到你的凝胶,以减少信号,同时保持特异性。我会一直在帮你解决任何问题,所以请随时联系我,我会尽我所能在会议结束时回答。现在我要把你交给格斯。

AM:大家好。感谢您的一个非常有趣和翔实的演示,马丁,和非常有价值的故障诊断荧光荧光印迹的提示。现在,我将讨论可能对荧光蛋白印迹实验有用的协议和资源。在我做之前,让我提醒你,如果你有任何问题,请随时通过屏幕右侧的问答面板提交。

我想首先强调Abcam的广泛和有效的第二抗体荧光荧光印迹,包括我们的FITC,DyLoE和Cyror预吸附二级抗体的最小物种交叉反应性。

我们也很高兴地告诉你,我们现在还提供Alexa For For®488, 555, 594和647共轭二级抗体。为什么你要选择我们的亚历克斯Fulor®共轭二级抗体?我们所有的Alexa次级都在室内进行了广泛的测试,以保证明亮的染色和低的背景。作为我们QC过程的一部分,我们在1/200稀释下进行二次抗体控制,以确保次级的特异性。此外,预吸附的二级抗体的选择是大的,以确保低种交叉反应性和抗原免疫球蛋白的识别。如果你想使用这些产品和ICC,你可以做至少250个实验,假设1/200稀释。了解更多关于这些链接显示。

我们的目录还包括广泛的抗体和蛋白质直接荧光检测。所示的例子显示了一个五星级审查的β-微管蛋白抗体中使用的荧光蛋白印迹。荧光结合的一级抗体,或在纯化蛋白中的检测,可以使用我们的高级搜索工具找到,并且在ABCAM网站的左手侧选择所需的缀合物,如图所示。

另一个有用的范围,用于建立荧光直接检测的荧光蛋白印迹,是EasyLink抗体结合试剂盒。EasyLink抗体结合试剂盒为荧光标记您的主要抗体提供了一种快速简便的方法。范围包括18个荧光标签的选择,在各种方便的尺寸范围内,以使您在实验设计的灵活性。了解更多关于链接上显示的EasyLink范围。

EasyLink工具包的一些好处包括它们用于直接染色协议,您可以从多路复用中受益,避免交叉反应。标签也共价连接到一个自由瞄准组,为你的实验产生一个完美稳定的共轭物。只有30秒的动手时间,有成本效益和快速的解决方案,有一个主要抗体,你将需要为您的实验。EasyLink缀合试剂盒需要注意的一点是,共轭依赖于抗体浓度。我们有浓度包可以帮助你,确保你有正确的浓度。此外,在缓冲液中BSA和叠氮化合物的存在也会影响共轭,并且我们也有提纯试剂盒来帮助您。通常,对于缀合物,您需要过量的标记抗体,并以1:1或4:1的比例结合。

只是为了再次提醒你,如果你有任何问题,请随时通过Q&A小组提交这些。为了简化您的过渡,以执行荧光蛋白印迹,我也想强调OpTiblot荧光蛋白印迹试剂盒。它们允许在一个印迹上荧光检测两种蛋白质,而不需要剥离和重新探测。试剂盒包含所有需要方便地进行荧光蛋白印迹的试剂。所述试剂盒包括低荧光PVDF膜、优化的缓冲液和两个荧光标记的二级抗体。具有试剂盒的二次抗体比CY染料更亮,并且可以用Cy3绿色和Cy5红色通道进行可视化。该试剂盒与许多非IR基荧光检测系统兼容,这些显示系统和马丁先前提到的一些。

如果向荧光蛋白印迹转变仍然是对您的挑战,允许您从荧光检测的一些优点中获益的试剂是高灵敏度的OpTiblot ECL底物的范围。除了化学发光之外,这些基材也是荧光的,允许增加灵敏度和维持信号。使用蓝色488 nm激光激发衬底,并且可以使用与Cy3染料的发射兼容的橙色滤光片来检测。OpTiblot系列的ECL工具包还提供了一系列其他功能,将增强您的Western blot协议的敏感性和灵活性。

除了荧光检测试剂,在Optiblot范围内,您还可以找到广泛的产品,旨在增强和简化您的Western blot协议。这包括Alexa荧光凝胶具有两年的保质期,染色威尔斯更简单的装载。缓冲剂和附件,如OpTiBlue蓝色,这是考马斯染色,在15分钟内提供凝胶染色,以及蛋白质梯子和低荧光PVDF膜。

此外,您可以在ABCAM网站上找到各种各样的资源,这可以进一步帮助您排除故障或设置荧光蛋白印迹。请访问所显示的链接以查找更多信息。还有Western blot疑难解答小册子,你可以下载作为实验的有价值的工具,或者你可以发电子邮件给我们的客户服务团队请求你自己的个人副本。

最后,我想提一句,作为一个感谢您出席研讨会,我们也提供了促销折扣25%的产品提到本研讨会。有关此报价的进一步信息将在网络研讨会后发送。

我也想借此机会让你们知道我们在2013期间可能会对你们感兴趣的一些额外事件。首先,有过敏和哮喘会议,这是发生在5月23日至5月24日在比利时布鲁日。请注意任何摘要和截止日期。接下来,我们有了我们的健康和疾病的炎症细胞,这是从6月24日到第二十五日在美国波士顿发生的。

除了一些即将到来的会议,还有一些额外的即将推出的网络研讨会,这可能是有意义的。这包括“IHC/ICC染色技术使用单一和多个标签”,3月6日,“互动或不互动?”免疫沉淀来回答这个问题,“这是在3月21日发生的。我想再次感谢您的时间,并听取研讨会。现在我将把你交给马丁,他会回答你提出的一些问题。再次谢谢你。

MB:所以我有一个来自凯特林的问题,它说:我发现相比之下,我需要装载更多的蛋白质用于荧光检测,与ECL相比,ECL似乎更敏感。这里,我认为这在很大程度上取决于你正在使用的检测系统。我当然发现ECL不太敏感,甚至是ECL的进步。这很可能取决于你所观察到的抗原。

维多利亚问:你对Li-COR系统中的二级抗体有什么建议,因为我比ECL经历了极低的信号?Victoria,我从Li-COR直接获得我的抗体,但你也可以使用一些Alexa Fluors®,我记不住他们的头顶,但我将能够回到你身上,所以我们可以整理出一些东西。

茉莉曾问:我试图比较两个独立的NMDA受体亚基,NR2A有很大的信号,但NR2B几乎没有出现,可以加载不同浓度的抗体这两个亚基?是的,非常好。你使用两种不同的亚单位特异性抗体。绝对好,没问题!

莫莉又问:“如果我们愿意,你如何建议我储存荧光蛋白印迹膜以备将来成像?让它们保持湿润,把它们放在黑暗中,用保鲜膜把它们包起来,保持湿润,然后把它们放进一些锡纸里,然后把它们粘在冷的房间里。

Rahila说:如果我们转向荧光蛋白印迹,我们将不得不使用荧光抗体,但我们可以使用这些荧光抗体进行常规免疫细胞化学吗?老实说,Rahila,这将取决于你将要使用的检测系统。你不能用Li-COR系统来做这件事,但是你应该和其他任何一个都好。纳丁问:荧光蛋白印迹的敏感性是什么,是PG还是FG?当然是皮克,但是,这又取决于你将要使用的检测系统。

这是熔岩问:ECL是什么?ECL是增强的化学发光。

谢谢你,马丁和格斯。我们已经到达网络研讨会的尾声了。对于任何尚未回答问题的人,我们会尽快与您联系。另外,为了让你知道,这个演示文稿的PDF副本可供下载。当您从WiBiar注销时,您将自动重定向到可下载版本的网页,以及正在运行的特殊网络研讨会促销的信息。如果您有任何关于荧光蛋白印迹或任何科学查询的问题,请随时联系我们的科学支持团队,他们将非常乐意帮助您。他们可以通过电子邮件联系。技术@ abcAM.com. 我们希望您已经发现这个网络研讨会有用和翔实,我们希望欢迎您到另一个网络研讨会在未来。谢谢你的参与,祝你好运。

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