Western印迹网络研讨会简介

观看我们的居民Western blot专家介绍的这种按需网络研讨会

Western印迹(WB),也称为免疫印迹,使用特异性抗体来分析含有多个蛋白质的样品中的一种蛋白质。蛋白质通过凝胶电泳的大小彼此分离,然后转移到膜上并用特定抗体检测。该技术被广泛应用于生物研究,因为它提供了关于蛋白质分子量的信息,以及样品之间表达的相对差异。

审核本研讨会的样品准备和故障排除技巧。

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网络研讨会主题:

  • 样品制备
  • 电泳
  • 蛋白质转移与染色
  • 控制装置
  • 故障检修
  • 抗体选择

主持人:

Caitlin Buckspan于2007在佛罗里达大学获得生物工程学士学位,2010在圣地亚哥加利福尼亚大学获得生物工程硕士学位。在佛罗里达大学,她研究了白蚁激素水平的季节性变化,她的研究主要依赖于Western印迹。

凯特林的硕士论文集中在使用小鼠模型的间充质干细胞的年龄相关的变化。她于2010加入ABCAM科学支持小组,是组织化学学会和国际干细胞研究学会的现任成员。


网络研讨会转录本:

女士们,先生们,大家好,感谢大家的支持,欢迎大家来到今天的演讲:介绍Western印迹原理和故障排除。今天的主持人是Jaime Robinson,Abcam的项目经理。我现在想把会议转给鲁滨孙女士。

JR:您好,欢迎您访问ABCAM的网络研讨会,介绍Western Butt原理和故障排除。主要主持人将是凯特林BACKSPAN,ABCAM的科学支持小组的成员。凯特林于2007在佛罗里达大学获得生物工程学士学位,2010在圣地亚哥加利福尼亚大学获得生物工程硕士学位。在佛罗里达大学,她研究了白蚁激素水平的季节性变化,这项研究很大程度上依赖于蛋白质印迹。她的硕士论文集中在使用小鼠模型的间充质干细胞的年龄相关的变化。她于2010加入ABCAM科学支持小组,是组织化学学会和国际干细胞研究学会的现任成员。

今天加盟凯特林将是Mandeep Sehmi,我们核心团队的一员。Mandeep完成了阿斯顿大学应用生物学和人类生物学的学士学位,莱斯特大学的分子病理学和毒理学硕士学位。Mandeep继续在莱斯特医学研究理事会毒理学单位工作,研究B细胞白血病,并在那里完成了B细胞免疫学博士学位。在她的博士,她致力于确定一种新的膜蛋白在B细胞淋巴瘤称为HVCN1,这表明有重要的作用,在正常的B细胞功能,然后亚型的B细胞淋巴瘤。曼森在2011加入了ABCAM。

如果你在演示过程中有任何问题,他们可以随时通过屏幕右侧的Q&A面板提交。您提交的问题将在网络研讨会结束时的故障排除部分得到解答。现在我将把它交给凯特林,她将开始介绍Western blot原理和故障排除。享受网络研讨会!

大家好,感谢大家加入我们的Western blot研讨会。今天我们将通过Western Butt的基本原理,我将展示一些故障排除技术的例子。请记住,如果你有任何问题,请把它们提交到屏幕右侧的Q&A面板上,我将在演示结束时回答他们中的一些问题。

那么什么是Western印迹,它是如何工作的?这是一项复杂的技术,但总结起来,它被用来鉴定含有大量蛋白质的样品中的一种特定蛋白质。首先,利用凝胶电泳将蛋白质按分子量彼此分离,然后用特异性抗体鉴定感兴趣的蛋白质。因此,我们可以通过将结果与分子量的蛋白质标准进行比较来确定感兴趣的蛋白质的分子量,并且我们也可以确定样品中感兴趣的蛋白质的相对量。例如,在这个Western blot图像中,您可以看到,感兴趣的带,即对照蛋白β肌动蛋白,与已知分子量的这些蛋白质相比,约为38 kDa,它们与我们的样品并排运行。在第二道,用较少的抗体染色这个特定的样本,因此带显得比其他的更模糊。

基本上,Western印迹是有用的工具,任何时候你都想知道你的样本中蛋白质表达的信息,比如这里列出的。它们可以用来指示样品是否表达感兴趣的蛋白质,或者它们可以用来提供关于不同样品或治疗组之间的相对表达的信息。如果您的最终目标是在免疫组织化学中使用抗体,或者免疫细胞化学,因为交叉反应可以在Western印迹中很容易看到,它们是非常有用的,因为蛋白质在视觉上彼此分离。

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在这篇文章中,我们将讨论Western印迹的步骤,并讨论在实验过程中应该使用的控制,以及选择合适的抗体用于检测。最后,我将用几个Western印迹法中常见问题的故障排除和优化实例来结束。一个伟大的西方印迹的第一步是正确地准备你的样品,因为最终的结果永远不会比原料更好。制备样品有三个主要步骤:裂解、蛋白质浓度的测量和还原和变性。

裂解,本质上是用缓冲液和机械搅拌来溶解细胞或组织中的蛋白质。所有这些都是在冰上完成的,在缓冲液中加入新鲜的蛋白酶抑制剂,因为要记住在细胞和组织中有活性蛋白酶,如果允许的话,可以破坏样品。该协议对于细胞或组织样本略有不同,但实际上是相同的概念。将样品均匀地溶解在溶解缓冲液中搅拌,然后离心分离并收集上清液。

一旦样品被完全溶解,测量蛋白质浓度。无论你喜欢哪种方法,都可以使用布拉德福德或BCA测定法。这将是重要的了解电泳步骤,以确保你加载等量的蛋白质每样品。

样品预处理的最后步骤是还原和变性,这打破了更高水平的结构,使得蛋白质可以根据电泳的主要氨基酸结构在电泳过程中分离。这是通过添加含有还原剂的缓冲剂,以及洗涤剂,一般在95°C下加热5分钟。在较低温度下加热对于某些蛋白质,尤其是多通道膜蛋白,可以更优选地在较高的温度下聚集。

接下来,我们将进一步讨论裂解减少和变性。因此,对于裂解步骤提出了更多的建议,这对于确保蛋白质实际上完全溶解是很重要的。首先,正如我们所讨论的,尽可能保持冰块和冰,并在蛋白酶缓冲液中加入蛋白酶抑制剂。另外,如果你计划检测一种蛋白质的磷酸化形式,你还需要添加足够的磷酸酶抑制剂。最后,最佳裂解缓冲液取决于感兴趣的蛋白质的细胞定位,因为需要更强的缓冲液如NMP-40或RIPA来完全溶解细胞中的膜或细胞器结合蛋白。

为了减少和变性样品缓冲液,缓冲液含有两种试剂:SDS或十二烷基硫酸钠,或β-巯基乙醇或二硫代苏糖醇,简称DTT。SDS是一种变性剂,有助于将蛋白质分解为氨基酸结构,并且以负质量电荷均匀地包覆蛋白质。在电泳的下一步骤中,这种负电荷的均匀比率将是必不可少的。β-巯基乙醇和DTT是还原它们的硫化物键的还原剂,也将蛋白质分解成线性的初级氨基酸结构,这在图像中都被简化。作为一个旁注,偶尔感兴趣的蛋白质需要非还原或非变性,通常是因为特定的抗体只识别这种形式的蛋白质。因此,如果需要的话,可以减少还原和变性步骤,但大多数的Western印迹是运行和变性减少的条件。所以样品一旦准备好,就可以进行凝胶电泳。

我们已经提到,凝胶电泳被用于根据分子量分离蛋白质。我们实际上是在电场中分离蛋白质,并利用不同大小的蛋白质以不同的速率通过凝胶基质的事实。该图像示出了用于凝胶电泳的典型设备。

在Western印迹中最常用的电泳类型是缩写SDS-PAGE。SDS是在该过程中加入缓冲液中的变性剂。PAGE代表聚丙烯酰胺凝胶电泳,因为凝胶通常由聚合丙烯酰胺制成。那么SDS-PAGE是如何工作的呢?我们从多孔的凝胶基质开始,由高度交联的丙烯酰胺制成,浸入充满水缓冲液的腔室中。将蛋白质裂解物的样品加载到凝胶的威尔斯中。井是每个车道的顶部,基本上是凝胶中的洼地,所以有空间容纳裂解物直到电流被施加。当电流被施加时,蛋白质会向正极迁移,因为它们被编码在带负电荷的SDS中。因为较小的蛋白质较少受到凝胶基质的抑制,所以它们会通过凝胶更快地移动,当电流被去除时,它们将进一步在凝胶下,所以蛋白质根据大小彼此分离。

凝胶由聚合丙烯酰胺制成,在过硫酸铵和TEMED存在下通过BIS交联。凝胶的结构可以通过改变丙烯酰胺的比例来控制。基本上,通过增加总丙烯酰胺百分比,凝胶基质的孔隙变得更紧密,从而减慢小蛋白质。由于这个原因,当研究更小的蛋白质时,高百分比凝胶是很大的,反之亦然,较低的丙烯酰胺百分比导致凝胶基质的较大孔隙,这允许较大的蛋白质更容易地迁移并在凝胶中更有效地分离。也有由不同丙烯酰胺百分比的层组成的梯度凝胶,使得这些小的和大的蛋白质可以在相同的凝胶上有效地运行。如果你在相同的印迹上分析大量的蛋白质,或者如果你不确定你感兴趣的蛋白质的分子量,我会推荐这些。

如前所述,有时你不想感兴趣的蛋白质是在减少变性的形式。这将影响在电泳过程中运行缓冲液的配方,以及样品制备过程中的缓冲液。这是一张可以用作参考的图表,但基本上你可以记住,如果蛋白质需要在非变性的,也被称为原生形式,从装载缓冲器和运行缓冲器中除去SDS。如果蛋白质需要处于非还原态,也称为氧化形式,则从负载缓冲液中除去β-巯基乙醇或DTT。

凝胶电泳后的下一步是蛋白质转移。转移步骤是Western印迹中的“印迹”一词产生的原因,因为蛋白质会从凝胶转移到另一个表面。这是因为凝胶是一个很差的用于免疫检测的底物。抗体不粘在蛋白质上,凝胶非常脆弱,很容易被撕破。因此,我们将蛋白质转移到更持久的底物以进行随后的免疫染色。

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转账怎么办?这是一个与电泳相似的原理,它将把带负电荷的蛋白质移向电场中的正极。凝胶被放置在多孔膜附近,并且将该膜和凝胶的夹层添加到与最靠近极点的膜的转移盒中。小心避免凝胶和膜之间的气泡,因为空气是绝缘体,不会传导电流,所以蛋白质不会通过气泡传递。我建议用锥形管的长边滚动转移夹层,以去除气泡。一旦夹心在盒中,施加电场,蛋白质以与凝胶中相同的构型迁移和粘附到膜上。

有许多不同种类的膜可用,有不同种类的材料,通常PVDF或硝化纤维素,并且也有不同的孔径。每一个都有不同的特性,我建议使用PVDF时,印迹蛋白质难以转移,但PVDF也可以有助于高背景在某些情况下。所以你可以尝试几种不同的膜,看看你的系统和样品蛋白质的效果如何。转移后,我总是建议使用可逆的蛋白质染色,如胭脂红在膜上,以确保蛋白质完全从凝胶转移。

有两种常用的转移方法:湿法和半干法。主要的区别在于,在湿传递中,夹层被淹没在充满转移缓冲的腔室中,在半干的情况下,夹层被直接放置在阴极和阳极之间。半干性较快,但膜可干燥并抑制蛋白质转运。湿转移是更耗时的,但它是最佳的方法,当传输蛋白质可能难以转移,如大蛋白或疏水蛋白。

说到转移大蛋白,我建议在转移大于100 kDa的蛋白质时采取一些步骤。在低电压和低温度下使用湿转移和过夜。另外,在转移缓冲液中加入SDS,这将有助于防止蛋白质在凝胶中沉淀。在转移缓冲液中将甲醇降低到10%或更少,这有助于凝胶膨胀和释放蛋白质。如果使用PVDF膜,可以完全从缓冲液中除去甲醇。当转移大蛋白时,再次使用膜上的胭脂红染色以确保蛋白质确实转移也是重要的。在蛋白转移到膜后,它可以被染色并用特定抗体显现。

我们为什么需要抗体?你可以在凝胶中使用像Coomassie这样的蛋白质染色,或者在膜上使用Ponceau,但是这些都是非特异性的污点,并且会显示样品中的每一种蛋白质,比如左边的图像。很难说哪种蛋白质是感兴趣的蛋白质,而试图比较样品之间的蛋白质的量就更难了。因此,使用特异性抗体,使得只有感兴趣的蛋白质被可视化,如在右侧的图像中。

免疫染色步骤的第一步是用中性蛋白质阻断膜上的裸露空间。这是重要的,因为膜是所有蛋白质的粘附表面,因此游离抗体可以与暴露的膜非特异性结合,但是抗体不应该与中性蛋白结合。为了阻挡膜,将膜置于盘中,用TBST溶液和3-5%的牛奶或BSA溶液覆盖。牛奶或牛血清白蛋白中的蛋白质与膜结合以覆盖游离膜,因此抗体以后不会粘附在这些区域。该盘应放置在摇杆上,在室温下搅拌1小时,或在4°C过夜。

一旦膜被完全堵塞,将封闭溶液倒出,并加入稀释的一级抗体溶液覆盖膜。抗体可以在TBST或阻断溶液中稀释。如果你第一次用你的样本使用抗体,你可能想尝试几种不同稀释的抗体,以找到最佳的稀释因子。让它在室温下孵育一小时,或在摇臂上4°C过夜,抗体将与膜上感兴趣的蛋白质结合。

一旦抗体结合,需要清洗膜以除去任何残留抗体。我建议用TBST在摇椅上3-5次洗涤,每次洗涤约10分钟。

在一级抗体之后,膜将被与可容易地可视化的分子结合的二级抗体处理。二级抗体对一级抗体具有特异性,因此它与一级抗体结合,因此广泛地与感兴趣的蛋白结合。将二次抗体在室温下孵育约1小时。

再次,彻底清洗膜,去除残留的二级抗体。TBST约3-5次,约10分钟就足够了。一旦膜被洗涤,它就准备通过与二级抗体结合的分子检测蛋白质。

有三种检测方法是最常用的Western印迹法。第一个是使用化学发光基底,如ECL或ECL Plus,这是更敏感的检测。在这种情况下,第二抗体将与辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶结合,催化与ECL反应,产生在膜上捕获的发光信号。类似地,例如4-氯萘酚或DAB的显色底物可以与酶偶联的二级抗体一起使用,以将有色产品直接沉积在膜上。在这种情况下,不需要特殊的检测设备,所以如果你刚开始在实验室中运行Western印迹,这是一个很好的选择。第三种选择是使用与荧光分子结合的二级抗体,这种荧光可以使用专门的检测系统来检测。

作为每一个精心策划的实验的一部分,有一些控制是应该使用的,现在我们将讨论一些重要的控制在Western印迹中使用。在Western印迹法中经常使用负载控制,它是一种抗体,它除了针对感兴趣的蛋白质外,还使用了抗体。负载控制的目标是一个普通的蛋白质,样本应包含大致相同的比例。因此,假设在电泳过程中从每个样品中的相同量的蛋白质被正确地加载到凝胶中,应该有类似大小的载荷控制目标带。如果加载过程中出现错误,加载控制带将显示此错误。您选择的目标将取决于您使用的是哪种样品裂解液。如果您有一个完整的细胞裂解物,一般β-肌动蛋白,GAPDH或微管蛋白将被用作负载控制。对于线粒体部分使用VDCA1或COXIV,并且对于核部分使用LAMIN B1或TATA结合蛋白抗体。

值得注意的一个重要注意事项是在比较不同样品之间的负载控制结果时要小心,因为抗体的结合亲和力可以在不同形式的蛋白质之间变化。在该图像中,例如,每个车道装载相同数量的来自不同物种的样本,并用β-肌动蛋白抗体染色。虽然车道被正确装载,但是在泳道三中的鱼样本中的带比其他的更微弱,但是这是因为抗体对鱼β肌动蛋白蛋白具有较低的结合亲和力。

除了加载控件之外,在未知的示例旁边运行正控件和负控件示例也是一个好主意。阳性对照基本上是已知含有感兴趣蛋白的样品,例如重组蛋白、转染的细胞系或已知表达蛋白质的组织或细胞。已知阴性对照不包含感兴趣的蛋白质,其可以是敲除或siRNA样品,或不表达感兴趣蛋白的组织或细胞。

另一种有用的控制是阻断肽,其更常用于抗体,其中免疫原是短肽序列,而不是全长蛋白质。为了使用肽作为对照,用肽预处理抗体,使抗体的特异结合位点被肽结合和阻断。然后将预处理的抗体与膜孵育。任何特定的带不会出现在膜上,因为结合位点被阻断。如果有强的带出现,它们必须是由于抗体的非特异性结合。在该图像中,在通道三和四中没有带,这是因为在这些车道上使用的抗体用免疫原肽预处理。在其他通道中,抗体用与免疫原非常相似的肽预处理,并且由于在这些通道中出现条带,表明抗体不与非免疫原肽结合,显示抗体的特异性。

接下来,我们将在选择一种适合于您的Western印迹的抗体时,考虑两件事。第一个似乎很明显的标准是选择一种在Western印迹中成功检测的抗体。这很重要,因为不是所有的抗体都能在Western印迹中发挥作用。如果你在ABCAM网站上,我们将在测试的应用程序中列出WB,如果我们已经测试了抗体,它在Western blot中工作。所以,在寻找合适的抗体时,一定要检查这一部分。如果Western blot未被列为应用程序,抗体可能在本申请中还未被测试,我们鼓励您在本例中联系我们的科学支持部门。我们的科学支持小组的联系细节将在本次报告中给出。

现在,抗体靶区的特定区域可能对你的研究有重要意义。如果你正在研究一种特定的蛋白质亚型,或者是前体与成熟蛋白,你应该对抗体的特异性感兴趣。你可以经常通过观察抗体所引发的免疫原序列来找出抗体的哪个区域,因为动物会产生识别这个特定序列的抗体。如果抗体是多克隆的,那么它将识别整个免疫原序列,但是如果它是单克隆的,它只识别序列的一个短部分。如果你正在研究的蛋白质有特定的亚型,那么确保免疫原区域与你的特定目标所包含的区域重叠。

现在,我们已经讨论了如何运行一个巨大的Western印迹,我们将讨论如何在结果没有预期的情况下对结果进行故障排除。你最终可能会运行一个类似于这幅图像的Western印迹,其中车道完全是空白的,或者可能有微弱的预期分子量的带。如果在印迹上根本没有带,则蛋白可能不转移到膜上,可以用胭脂红染色再次检查,或者二次抗体与第一抗体不相容。样品可能不表达感兴趣的蛋白质,这可以用一个与未知样品并列的阳性对照样品来检验。如果条带很弱,则可以增加蛋白质载量和所用抗体的浓度。你可以在短时间内改变阻断剂或阻断剂,并且可以增加抗体孵育的次数。如果你使用化学发光检测,我也建议曝光一段较长时间的胶片,以获取可能在印迹上的任何条带。

你也可能遇到比预期高的背景或更多的乐队。我建议增加加载到凝胶上的裂解物的量,进一步稀释抗体,改变阻断剂,并尝试使用硝酸纤维素膜,如果你使用PVDF。如果你使用化学发光检测,你也可以减少曝光时间。如果存在比感兴趣的蛋白质更低的分子量的额外带,则可能归咎于降解。确保蛋白酶抑制剂被添加到样品缓冲液中,样品保持在冰上。如果有额外的分子量带是预期分子量的倍数,例如在100 kDa时,只有50 kDa的带,则煮沸样品更长的时间以确保任何多聚物被破坏。您可以检查文献,我建议SwissProt网站查看蛋白质是否翻译后修饰,如糖基化,乙酰化或磷酸化,或者如果它具有不同的异构体或裂解片段,这可以解释额外的带上的印迹。

这是我们自己的内部测试的一个具体例子,在一个带有大量抗体的印迹上有很高的背景。技术人员认为他们可能错误地稀释了1毫克/毫升的抗体,所以他们只是简单地从原料溶液中重新稀释了工作稀释液,同时稀释了10倍和100倍的样品裂解液,以确保安全。新的结果显示,理想的Western印迹法,仅从稀释抗体和样品。

这是另外两个有趣的片段,因为这些抗体与特定的阻断剂作用得更好。左边的抗体,如你所见,当膜被5% BSA阻断时显示出多条带。然而,一个清晰的,但微弱的带被视为使用5%牛奶作为阻断剂。这并不是说牛奶永远是理想的选择,但是,正确的图像中的抗体用5%的牛血清白蛋白提供了更强的信号,当膜被牛奶堵塞时几乎无法检测到。许多抗体在牛奶或牛血清白蛋白中都能起到很好的作用,所以如果初始结果不是最佳的,你可以用不同的阻断剂进行实验。如果你用磷酸特异性抗体印迹蛋白质,那就意味着它只能检测磷酸化的蛋白质。我们建议使用牛血清白蛋白作为阻断剂。乳内含有磷酸酶,其能从感兴趣的蛋白质中切割磷酸基团,从而抗体不能结合,从而导致没有带。如果我们确实知道一种特定的抗体与一种阻断剂的效果更好,我们会直接把它放在数据表上,但是如果你想知道它被测试的更多细节,我们随时都可以联系我们。

这是一个多重问题的例子,我会指出,这种抗体没有通过QC,是不出售的,所以不用担心。但这张照片确实显示了一些我想讨论的常见问题。首先,有证据表明,在传输过程中存在气泡,在传输过程中没有传导电流,因此蛋白质没有迁移到该点的膜上。避免这种情况的一个简单方法是在组装过程中,用锥形管的侧部将凝胶和膜夹心翻出来。还有一些洗涤不良的地方,其中一个试剂聚集在膜上。为了避免这种情况,确保所有的溶液覆盖整个膜,并在孵育过程中摇动或搅动膜。最后我想指出的是在右上角的区域,在凝胶和膜之间有不完全的接触,这可能是由于凝胶的折叠或凝胶的撕裂。如果凝胶不平整在膜上,再次用圆锥形管的侧面平滑三明治,以确保所有区域都接触。如果你的凝胶经常撕裂,你可以尝试使用不同种类的凝胶,例如我们最近添加到我们的目录中的Optiblot凝胶,这些凝胶比传统凝胶强10倍。因此,在西方的印迹中,有很多事情可能会出错,但这些都是可以解决的问题。这是一个好习惯,你的膜染色后的胭脂红染色,因为你可以提前发现这些问题,并重新运行电泳和转移,如果必要的话。

这是另一个不完全转移的例子,但在这种情况下,只有大的蛋白质有困难转移到膜上。你可以看到,至少有一个高分子量的蛋白质标准,但这些还没有有效地转移。如果你看到这样的东西,只需遵循前面提到的转移大蛋白的建议,例如在低电压下过夜湿转移,并降低转移缓冲液中的甲醇量。如果你看到了相反的问题,意味着只有高分子量的蛋白质在膜上,你可能已经过度转移,使小的蛋白质直接穿过你的膜迁移,因此在这种情况下缩短你的传输时间或电压。

最后,对于最后的例子,这里的抗体的情况下,在其非还原的、非变性的条件下对蛋白质具有更高的亲和力。这意味着SDS和β-巯基乙醇或DTT,不用于加载缓冲液或页运行凝胶。这幅图像是由一位外部研究人员提交的一篇优秀评论的一部分,该研究人员发现,当左心室中的蛋白质被还原和变性时,胶原蛋白III抗体就产生了一条弱带。当蛋白质在右侧车道样品中未被还原和变性时,表现出更强的条带。该带是大约300 kDa的,是由两个α链组成的二聚体,在还原的变性条件下单独运行约130 kDa。在其原生形式中,蛋白质具有三维形状,抗体可能沿3D形状具有强结合位点,但一旦蛋白质被还原和变性,则失去。

最后一点,我想重申的是,真正了解你感兴趣的蛋白质的生物化学是多么重要,因为西方的印迹很大程度上依赖于这方面的知识。每个印迹不一定会给你一个预期分子量的带,但这不一定是担心的原因。可能存在翻译后修饰或裂解事件,这导致蛋白质以不同的大小运行,或者您的样品可以表达特定的蛋白质亚型。当不确定时,参考SWISPROT网站或现有文献,了解更多关于你目标的信息,如果你需要任何帮助,或者你的Western blot的任何一部分,请随时联系ABCAM科学支持团队。稍后将在演示文稿中提供科学支持小组的联系细节。

现在我们将把演示文稿交给Mandeep,他将概述ABCAM为您的Western blot需求提供的研究工具。我们所有的网站都可以在研讨会结束时下载,供您参考。在Mandeep的陈述之后,我将可以回答一些已经发送给我们的问题,所以请继续提出问题,如果你们还没有的话。

谢谢你,凯特林。正如我提到的,我将审查一些产品ABCAM提供支持您的Western blot实验。在我这样做之前,我想提醒你们,你们可以自由地提出任何你们希望凯特林回答的问题。除了良好的特征,初级和次级抗体,我们的目录还包括一些产品,以支持您的Western印迹从我们的试剂范围到我们的丝裂原范围。首先,我将介绍我们的试剂范围,其中包括我们的核心Western印迹范围,Optiblot,我们的棱镜蛋白质梯子,EasyLink缀合试剂盒,以及控制和裂解物,和ECL试剂盒。正如凯特林所提到的,幻灯片的PDF将在网络研讨会上下载,因此你可以参考这些链接。

我们的OpTiblot系列包括凝胶、缓冲剂和辅助试剂,它们旨在增强您的Western印迹和改进现有市场上的产品。使用从我们的OpTiBrutt范围内的预制凝胶,您可以受益于一年的保质期,以及使凝胶更容易使用的其他特征,如威尔斯,易于可视化和增加强度和易用性。为了配合预制凝胶,我们还提供了配方,以优化凝胶的运行,可以购买或准备在实验室使用缓冲食谱在我们的网站上可用。此外,我们的OpTiBrue范围包括辅助试剂,如OpTiBlut-Blue,允许您在15分钟内染色蛋白质;Optiblot Bradford reagent,用于洗涤剂相容的蛋白质定量。我们还提供试剂包,包括所有凝胶和缓冲液,您将需要方便地运行您的实验。通过访问显示的链接,您可以找到有关Optiblot范围的其他信息。

我们的试剂范围还包括预染色棱镜蛋白质梯子,可用于估计蛋白质的大小,并确定Western印迹转移效率。有多种颜色的荧光带,你可以很容易地估计你的蛋白质的大小,它们的宽范围涵盖范围广泛的分子量。如果您想使用一种抗体进行更快速的检测,您可以使用我们的EasyLink缀合试剂盒将标签(例如HRP或碱性磷酸酶)与您的主要抗体在20分钟内缀合。另外添加Western印迹辅助试剂,还包括装载控制,以确保裂解液和加载到凝胶上的量相等。裂解物可作为阳性对照和ECL试剂盒用于敏感检测。请访问显示的链接进一步探索这些产品范围。

如果您正在从事代谢或线粒体研究,ABCAM推荐我们的丝裂原系列产品,它提供了一种综合选择单克隆抗体、裂解物和试剂盒,旨在优化您的研究。丝裂原单克隆抗体是高度优化和验证工作在一系列物种。这些包括人类、果蝇、猴子、牛、啮齿动物和酵母。我们也有线粒体裂解物从特定的组织,可以用在您的Western印迹作为阳性对照。如果你喜欢自己分离线粒体或细胞质蛋白,我们也提供了一系列细胞分馏工具。

我们的流行的Western印迹抗体鸡尾酒是优化的,预混合的解决方案的抗体的Western blot分析的目标和控制酶或蛋白质的关键面板。这些鸡尾酒的优势在于可以在一个泳道中检测到一些蛋白质,所以你可以在一个Western印迹中分析各种样品,如图中所示。

有丝分裂免疫捕获抗体和试剂盒可用于从其组织或细胞的小样本中分离出完全完整的、完全激活的状态下的大的酶复合物。对于试剂盒,免疫捕获抗体与蛋白G琼脂糖珠不可逆地交联,这允许酶的纯化作为亚单位组成的后续分析和翻译后修饰。免疫捕获抗体也可单独用于合并到您自己的应用程序中。在图中示出了一个例子,其中,已经使用免疫捕获试剂盒AB10715显示了OXPHOS通路的一部分ATP合成酶是免疫沉淀的。蛋白质谱带的身份在这里显示,通过质谱证实。

如果你在干细胞研究中工作,我们有一系列测试胚胎干细胞的抗体,如OCT4、SOX2和Nanog。对于生殖细胞的研究,我们提供,例如,DDX4,DAZL,斯特拉,GCNF和PIWIL2。对于癌症研究,这些是我们推荐的最好的抗体。如果你正在研究癌症代谢,我们有mTOR、TGF-β和VEGF等。对于缺氧,我们推荐我们的HSP90和HIF1α蛋白抗体。通过访问我们的网站,您可以发现更广泛的选择用于干细胞、癌症研究和所有其他研究领域的Western blot抗体。

ABCAM的目录包括超过2500个二级抗体。对于Western印迹,二级抗体主要耦合到酶,如HRP和碱性磷酸酶。我们也有抗体,可以在荧光扫描仪上进行检测。第二抗体与内源性免疫球蛋白的交叉反应可能是一个值得关注的问题,特别是当样本组织中含有非常丰富的免疫球蛋白时。为了解决这个问题,我们建议使用一种我们的预吸附的抗体,这是可预吸附的多达三种或八种。如果您的二次抗体特异性是一个问题,我们建议使用我们的Fc特异性抗体之一。与二级抗体相反,识别重链和轻链,Fc二级抗体仅与一级抗体的重链结合。例如,山羊抗小鼠IgG H&L抗体可以潜在地结合其他IgG的小鼠免疫球蛋白的轻链。当山羊抗小鼠IgG Fc继发时,这种风险被废除。

当使用重链和轻链特异性抗体进行免疫沉淀样品的Western印迹检测时,可能出现/出现两条带。重链在50 kDa左右,轻链在25 kDa左右。在您感兴趣的蛋白质,已经在50 kDa范围内的情况下,重链可以阻碍感兴趣带的检测。为了解决这个问题,简单地使用我们的轻链特异性二级抗体之一,它将不再认识重链。

为了提醒您,您可以找到关于此幻灯片上显示的链接的有关产品的附加信息,以及在WebIAR的PDF副本中的附加信息,这将在最后下载。对于更多的提示和提示,您可以找到有关Western印迹协议、指南和常见问题的信息,以及我们的ABCAM网站上的Optiblot范围,使用所示链接。

ABCAM科学支持小组将乐于帮助您进行任何查询。支持有多种语言,包括英语、汉语、日语、西班牙语、德语和法语。在美国北部或南部,您可以在我们的美国办事处联系我们。对于香港、中国和亚洲,您可以联系我们的香港办事处。对于英国和欧洲,您可以联系我们的英国办事处和日本,我们的日本办事处。

作为一个感谢您观看网络研讨会,我们也提供了促销折扣25%的产品提到本研讨会。要了解更多关于这个促销和开始储蓄,请访问显示的链接。谢谢你的时间。我现在要把你交给凯特林,他会回答一些已经收到的问题。

感谢所有提问的人。如果时间允许的话,我们将尽可能多地过去。看起来很多人对使用同一蛋白质的装载控件有疑问,其大小与感兴趣的蛋白质相同。因此,当使用加载控件时,有两个不同的选项。因此,β-肌动蛋白是更常用的负载控制之一,约为38 kDa。但是如果你感兴趣的蛋白质在38 kDa左右,你仍然想要使用β-肌动蛋白,你可以用β-肌动蛋白抗体进行检测,然后从膜中剥离抗体,然后使用你的其他抗体。你当然可以这么做。我们有一个协议剥离和重新探索在我们的网站上,在ABCAM网站和科学支持部分;有一个协议,这样做。我建议只使用不同分子量的负载控制。

对于任何类型的蛋白质,或者任何类型的样品,都有几种不同的加载方法,所以使用不同的负载控制可能比较容易。这样做的好处是,如果你有一个与你感兴趣的蛋白质有显著不同的分子量的负载控制,你实际上可以在转移后,切割膜,然后用这两种不同的抗体完全分离。这样,你就不必再通过额外的步骤来剥离膜和重新探测。每次剥离,你都会失去膜上的一些蛋白质,这会影响你的结果,如果你试图定量或仅仅限定样品中你感兴趣的蛋白质的量。所以我建议选择一个比你感兴趣的蛋白质更接近的负载控制。

有一个关于Azada梯度凝胶的问题,谢谢你,Azada。你有一个专门的梯度凝胶制备方案吗?我建议购买它们。你可以制作它们,但是只要购买它们就容易多了,它们可以在不同的丙烯酰胺百分比范围内使用。一个普通的只有4-20%,在这个范围内,你可以分析大量的蛋白质。所以我建议购买4-20%的梯度凝胶。

我们有一个关于DEV的问题,主要抗体的持续时间有多长?我用了五岁的抗体,没有看到任何信号,抗体能降解吗?答案是肯定的。五年后,如果储存在负20°C,抗体可能是可行的,但是它们在储存时肯定会降解,所以我建议抗体在储存前工作良好,继续前进,获得一种新的抗体,它可能在储存时被破坏。

我们有一个关于卢克的问题——要求对磷酸化蛋白提出更多的建议,再次重复使用磷酸化蛋白。因此,第一步是确保你在样品制备过程中包括磷酸酶抑制剂,以及蛋白酶抑制剂,如果你还没有定期这样做的话。我们提到的第二个步骤是使用牛血清白蛋白,你可以使用3-5%的牛血清白蛋白作为你的缓冲缓冲液而不是牛奶。所以牛奶自然含有酶,可以分解磷蛋白,然后你的抗体就不能与它结合。

我们有一个问题从巴拉吉问是否阻断肽可用于磷酸抗体?是的,它们是。一般来说,对于大多数磷特异性抗体,有肽可用。如果它是检测蛋白质上一个特定的磷酸化残基的抗体,那么免疫原就必须是那个特定的区域。因此,如果没有商业上可用的肽,你可以制作一个肽,但是你会知道你必须制造一个肽到那个区域并在特定的残留物上磷酸化。

有一个来自Moosu的问题:当我开发我的膜时,有时我的带子周围有斑点,我增加了洗涤周期,并且在Ponceau上没有气泡。我假设斑点可能是一种斑点状的外观,只是隔膜,有时你会发现这是阻断溶液,牛血清白蛋白或奶粉没有完全溶解在溶液中,在TBST,所以你最终有一些斑点或一些点在你的膜上。在你的一个解决方案中也可能有一些污染,这可以显示为点或斑点。因此,如果你认为它可能是污染,当然,你可以消毒过滤你的解决方案,或者你可以提出新的解决方案。如果你认为你在TBST中溶解牛奶或BSA粉末有一些麻烦,你也可以在添加粉末后过滤你的阻挡溶液。这可以消除任何可能形成的斑点,但是这不是转移的问题,所以你的胭脂水染色看起来不错,但它们只是因为你的解决方案中存在其他的东西而出现。

我们有一个问题,Mehmet:我没有均质机,但我有一个声波,这可以用来裂解我的组织?你可以用声波发生器,这很好。要注意的是,声波发生器的解决方案会变得非常温暖,所以你需要确保你不是一段时间长时间的声波。声波可能间隔15-30秒,然后在声波处理期间冷却你的溶液,并且确保你的样品仍然在冰上,即使你在声波。所以确保你的样品不会变热很重要,而且这种热量会损害你的蛋白质,那么你最终也会在你的印迹上产生高的背景。

我们有一个来自肯特的问题:我一直在观察被称为预吸附的二级抗体,这意味着什么,我需要用它们来进行免疫印迹吗?预吸附基本上是对一些二级抗体进行的额外预处理,并且除去与其他物种可能交叉反应的任何分子。因此,如果你有一个被预先吸附的抗鼠二级抗体,这意味着它已经被预先处理,以除去任何抗鼠分子或任何抗兔分子,因此次级是特异性抗小鼠。你不必用这种方法来进行免疫印迹,我认为对于免疫沉淀后的蛋白印迹更为重要,但是在你的免疫印迹中使用非预吸附的二级抗体应该是很好的。

我们有个问题:我实验室里有人做了一个Western印迹,印迹是黑色的,但是带是白色的,我们能解决这个问题吗?答案是肯定的。黑带上的白色带称为反条带,通常是由于使用化学发光法检测抗体太多而引起的。因此,这部电影有点被淬灭和过度曝光,你应该能够通过进一步稀释主和二级抗体,直到印迹看起来正常,然后再看到白色背景上的黑色条带。

简孝儒:谢谢你,凯特林和曼迪克。这样我们的研讨会就结束了。如果你的问题没有得到回答,我们将在接下来的48小时内得到科学支持,这样你就可以得到这些信息,并帮助你走出困境。我只是想为我们即将到来的会议浏览几张幻灯片,我们有一个干细胞组织会议将在四月召开。我们有组织干细胞的起源,这是在六月的爱丁堡,以及我们即将到来的网络研讨会。所以我们希望你喜欢这个网络研讨会,我们希望将来见到你。如前所述,如果您对西方印迹、任何其他科学查询有任何疑问,我们的科学支持团队将非常乐意帮助您并可以与您联系。技术@ abcAM.com. 如果你有网络研讨会或与事件相关的问题,你也可以联系活动小组。Evss@ abcAM.com. 谢谢你参加我们的网络研讨会,我想感谢Mandeep和凯特林今天成为我们的主持人。我们很高兴你参加了,我们希望能在未来的网络研讨会上再次见到你。非常感谢,保重!

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