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使用双重或三重标签间接方法通常使用不同种类的初级抗体。尽管用在同一物种中产生的初级抗体进行多重标记也是可能的。然后用与不同荧光团结合的二级抗体观察一级抗体。以下是在使用二级抗体时,您需要记住的一些重要提示:
理想情况下,所有次级抗体应来自同一宿主物种。使用来自第二代培养物所在物种的封闭血清,以避免非特异性结合并减少背景。
使用预先吸附的二级抗体以最小化物种的交叉反应性。如果可能,选择已经预先吸附的针对实验样品物种以及其他原虫宿主物种的二级抗体。
对低丰度蛋白质使用最亮的荧光团,反之亦然,以最大限度地提高灵敏度。荧光偶联物的亮度不同,抗原的表达水平也不同。高表达抗原几乎可以用任何荧光团分解,但低水平表达的抗原可能需要更明亮的荧光团,如R-藻红蛋白。
使用发射光谱窄的荧光灯来避免漏光(也称为交叉或串扰)。窄带通滤波器以较低的信号电平为代价。但是,即使使用窄带通滤波器,一个荧光团的发射也可能通过另一个的检测通道。
我们的Alexa Fluor公司®次级抗体范围提供九种不同的染料,光谱重叠最小,同时覆盖整个光谱。下表显示了九种Alexa Fluor之间的兼容性®我们提供的染料。
不同Alexa Fluor之间的兼容性®染料表示为高(绿色)、中(蓝色)或低(红色)。高兼容性表明荧光团之间没有串扰。由于荧光团之间的串扰很高,在同一实验中应尽可能避免使用低相容性的荧光团对。
Alexa Fluor公司®染料是最明亮、最稳定的标签。我们的Alexa Fluor®共轭二次曲线为:
例如,下面是根据上述建议使用二级抗体进行双重免疫染色实验的图像。
图片:由UMDNJ-Robert Wood Johnson医学院李少华博士提供
样品:小鼠胚胎干细胞分化类胚体(EB)
反染色:DAPI
山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor®594)预吸附(约150084)
与鸡、牛、马、人、猪、兔和大鼠的最小交叉反应性。
山羊抗鼠IgG H&L(Alexa Fluor®488)预吸附(ab150117号)
与人、小鼠和大鼠的交叉反应最小。
注:在本例中,这两个二级犬都是用山羊饲养的,因此它们彼此不认识。二级抗体也已被预先吸附,因此它们不能识别其他一级抗体以及组织中可能存在的内源性小鼠免疫球蛋白。
Alexa Fluor公司®是Life Technologies的注册商标。Alexa Fluor公司®染料共轭物包含生命科技授权给Abcam的技术。