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概述:
在4°C下储存不应超过1或2周。到达后,应快速旋转抗体管,将溶液下拉并等分二次抗体溶液。等分试样应储存在-20°C或-80°C的温度下。
Aliquoting将污染的可能性降至最低,并防止抗体因连续的冷冻/解冻循环而降解。避免制备小于10µl的小份样品,因为由于抗体在小瓶表面的蒸发和吸附,可能会影响储备浓度。
等分试样应储存在-20°C或-80°C的黑暗低蛋白结合管中。由于荧光团的光浸出,长时间暴露在光下会损害抗体活性。
抗体最好在运输时的同一缓冲液中稀释(0.02%叠氮化钠、1%牛血清白蛋白、30%甘油、PBS)。或者,您可以稀释PBS中的抗体。但是,我们建议以浓缩形式储存抗体,因为大量稀释可能会影响其稳定性。
数据表显示了最适合您的实验的阻塞解决方案。每次使用前,应使阻塞溶液新鲜。下面列出了用于特定应用程序的常见阻断剂。
*在添加抗体之前,阻断剂应完全溶解。未解决的阻塞代理可能会导致在实验期间生成伪影。
在封闭缓冲液中稀释抗体进行样品培养可能有助于最小化背景。样品也可以与缺乏阻断剂的抗体溶液培养,例如TBST(Tris Buffered Saline with Tween®20)。结果可能不同,但如果背景不是问题,我们建议用低浓度的阻断剂在缓冲液中稀释抗体。
培养时间主要取决于您感兴趣的蛋白质的表达。通常情况下,WB和IF/ICC只需要1小时的培养时间即可有效检测。
使用Alexa Fluor®结合二级抗体时,样品应在黑暗中培养。长时间暴露于光下可能导致染料的光漂白,从而影响二级抗体结合物的性能。
样品与Alexa Fluor®结合二级抗体孵育的温度通常取决于孵育时间。
检测用抗体的稀释度可能因应用、实验条件和您的特定目标而异。一个好的出发点是将二级抗体稀释为原抗体的十倍。然而,应使用次级抗体的系列稀释液绘制滴定曲线,以确定最佳稀释度。滴定应模拟预期实验的条件。
Alexa Fluor®共轭二级抗体的强荧光比其他类似染料提供更大的信号放大。二级抗体通常在样品培养期间在封闭缓冲液中稀释,以尽量减少非特异性结合。对二级抗体进行最佳稀释也有助于减少背景。确保在与抗体孵育后对样品进行广泛清洗。你还应该知道,长时间的潜伏期(如隔夜)可能会导致背景增加。
为了获得最佳结果,我们不建议重新使用Alexa Fluor®结合二级抗体。如果重新使用二次抗体溶液,应添加新鲜抗体,因为每次使用后有效浓度降低。
我们的Alexa Fluor®偶联二级抗体是多路复用的理想选择。它们已经过广泛测试,以确保高特异性和敏感性。我们广泛的Alexa Fluor®结合物针对多种物种,允许标记多种抗原。见下表,该表显示了我们当前的Alexa Fluor®结合二级抗体及其特征。
*小瓶中溶液的外观。
**通过带有适当滤光片的传统荧光显微镜看到的典型发射颜色。
***由于人类视觉对大约650 nm以上的光不敏感,因此不可能看到近中频荧光染料发出的光。
在计划一项复合实验时,使用Alexa Fluor非常重要®具有不同发射最大值(至少40nm差异)的共轭二级抗体。下图显示了我们目前提供的每种产品的发射光谱。
为了获得最佳性能,请尝试使用Alexa Fluor®无光谱重叠的共轭二级抗体。见下表,显示了双重和三重免疫染色的常见组合。
当使用不同物种(例如小鼠和兔子)中产生的一级抗体和专门针对每个物种的二级抗体时,预期不会产生交叉反应。如果使用在同一物种中培养的初级抗体,它们必须具有不同的同种型(例如IgG和IgM)。与特定同型反应的二级抗体将防止交叉反应。我们的产品目录包括多种Alexa Fluor®针对不同物种和同型的共轭二级抗体。
预吸附二级抗体是消除潜在抗体物种交叉反应性的理想选择。抗体的预吸附应使用与您的样本相同物种的血清进行。因此,物种吸附抗体不太可能与内源性免疫球蛋白相互作用,从而显著降低非特异性结合。我们提供广泛的预先吸附的Alexa Fluor®结合二级抗体.