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在我们的点播网络研讨会中了解我们如何克服使用KO细胞系的常见挑战。
抗体是生命科学和临床研究中最广泛使用的一些工具,用于研究蛋白质及其在生物途径和疾病中的功能。
良好的抗体显示靶点特异性、选择性和敏感性,即使在低表达水平下也能识别感兴趣的蛋白质。然而,越来越多的研究表明,并非所有抗体都具有靶向特异性,许多抗体与非靶向蛋白表现出交叉反应性。这是一个实验不可再现性问题1由于非特异性抗体导致资源浪费,并阻碍科学进步。2、3
敲除(KO)验证是一种稳健的技术,用于通过测试KO细胞系或组织中感兴趣的抗体来确认抗体特异性,其中目标基因已被编辑,因此目标蛋白未表达。4特定抗体将检测未经编辑的野生型(WT)细胞系中的特定靶蛋白信号,在KO细胞系。通过这种方式,KO验证可作为真正的阴性对照,以确认抗体对感兴趣蛋白质的特异性。4,5
在Abcam,我们使用大量人类KO细胞株库来验证我们的抗体我们的KO细胞系是通过CRISPR-Cas9生成编辑通过Sanger测序或NGS进行验证。我们还尽可能采用蛋白质组学验证。
查看我们的KO验证抗体完整列表
当KO验证我们的抗体时,我们主要使用西方的污点,污点以评估结果。KO验证可产生一系列western blot结果,以下示例说明了我们如何处理Abcam的每种情况。
图1。用抗EGFR抗体[E235](ab32077)在1/1000稀释度下对WT和KO样品进行Western blot检测。感兴趣的波段出现在WT中,而在KO样品中不存在。
所有车道:抗EGFR抗体[E235](ab32077)稀释1/1000
车道1:野生型A549细胞裂解物车道2: EGFR敲除A549细胞裂解物(ab286394)3号车道:野生型HeLa细胞裂解物车道4: EGFR敲除HeLa细胞裂解物(ab255385)
预测的带宽大小:134千帕观察到的频带大小:160千帕装载控制(红色带): 小鼠抗α-管蛋白[DM1A](ab7291)在1/20000次级抗体:IR染料800山羊抗兔IgG(H+L)IR染料680山羊抗鼠IgG(H+L)均为1/10000稀释
图2。WT和KO样品的Western blot用抗FACA/FAA抗体(97578)在1/1000处进行了检测。163kDa的感兴趣条带存在于WT中,而在两个印迹的KO样品中均不存在,因此抗体与Rab3a特异性结合。然而,ab3335型显示了WT和KO中存在的其他几个谱带,表明它不是选择性的。我们建议约201457因为它更具选择性,在65 kDa时只检测到一条微弱的非特异性带。
车道1:野生型SK-N-FI细胞裂解物车道2:RAB3A敲除SK-N-FI细胞裂解物(ab288708)3号车道:人脑细胞裂解物车道4:HEK-293细胞裂解物
预测的带宽大小:24千帕观察到的频带大小:27千帕
装载控制(洋红色带):小鼠抗α-微管蛋白[DM1A](约7291)稀释1/20000
次级抗体:IR染料800山羊抗兔IgG(H+L)IR染料680羊抗鼠IgG(H+L),均为1/20000稀释液
交叉反应抗体
图3。在KO裂解物上测试抗Akt1抗体。KO样品中存在正确MW下的预期带,但强度低于WT样品。额外的过度表达测试表明,抗体还检测到AKT3(数据表上显示的数据),其分子量与AKT1相同。抗体被重新命名。
所有车道: 抗Akt1兔单克隆抗体(ab32038)稀释1/1000车道1:野生型HAP1细胞裂解物车道2:Akt1敲除HAP1细胞裂解物
预测的带宽大小:55千帕观察到的频带大小:55-60千帕
加载控制(品红色带): 小鼠抗GAPDH抗体[6C5](ab8245)1/20000稀释,1/1000稀释
次级抗体:IR染料800山羊抗兔IgG(H+L)IR染料680山羊抗鼠IgG(H+L)均为1/20000稀释
图4。用抗TGFβ受体I抗体(ab31013)在1/1000稀释度下检测WT和KO样品的Western blot。WT和KO样品中存在非特异性带。
车道1:野生型A549车道2:TGFBR1敲除A549细胞裂解物(约277894)3号车道:A431细胞裂解物车道4:MOLT-4细胞裂解物
预测的带宽大小:27千帕观察到的频带大小:35千帕
装载控制(红色带): 小鼠抗GAPDH抗体[6C5](ab8245)稀释1/20000
当您看到KO验证印章时,您可以相信,抗体不仅在推荐的应用程序和物种中得到验证,而且其特异性已经通过我们的内部KO验证方法得到确认。3600个重组抗体经KO验证,具有无与伦比的特异性。
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应用CRISPR-Cas9技术与我们的高通量平台相结合,使我们能够大规模自动化生产CRISPR敲除细胞系。这减少了生产基因编辑单克隆细胞系所需的时间,因此您可以获得宝贵的实验室时间,对可扩展和长期供应充满信心,并随着时间的推移取得一致的结果。我们的现成细胞株可在五天内交付,为您节省宝贵的实验时间.
每个KO细胞系单独克隆,在许多情况下通过基因组测序和蛋白质组分析进行验证,并与亲本WT对照一起提供,以便在一致的细胞背景下评估敲除的生物影响。
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