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典型CRISPR-Cas9淘汰协议中的每一步都有可能导致失败的缺陷。
更新时间:2023年10月2日
随着CRISPR敲除(KO)细胞系的使用不断增加,许多研究人员正在探索如何在自己的实验室中生成细胞系。由于需要大量的时间投入和高水平的技术技能,生成自己的细胞株往往是一个令人沮丧的试错过程,直到最后都看不到失败。自动化和大规模CRISPR操作可以帮助优化您的协议1; 然而,许多实验室没有装备来处理如此广泛的操作。
进一步了解KO细胞系及其优点
内容:
簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)是构成细菌适应性免疫系统的DNA。这通过为核酸酶提供重复的靶DNA间隔序列来切割,从而保护细菌抵抗和消灭入侵病毒2转录的CRISPR序列引导Cas9酶切割DNA,使病毒基因组在特定位置失效和破坏。
CRISPR-Cas9的分子成分现在也可以用作真核细胞的基因编辑系统三该系统使用短合成的导向RNA延伸,将Cas9酶导向基因组中的目标位置。一旦到位,Cas9将DNA从目标序列的末端切割出三个碱基,从而精确地替换、删除或插入基因组材料。通过这种方式,可以切除一部分基因(从小到大的缺失)以消除基因功能,或者复制导致疾病的突变以提供基于基因的疾病模型。
CRISPR-Cas9技术对基因编辑和细胞系创建有许多好处:
然而,需要对各种元素进行优化,以成功产生精确的CRISPR-Cas-9淘汰赛。
研究人员生成CRISPR敲除(KO)细胞株的平均时间将近五个月,大多数研究人员被迫重启实验3-4次,才能获得所需的敲除细胞株3。
生成CRISPR KO细胞系的标准工作流程包括五个主要步骤,如下所示:
图1(上图):产生KO细胞系的基本基因编辑协议
可能更熟悉技术
慢病毒:对难以转染的细胞有效
时间消耗
需要额外的筛选代理
倾向于偏离目标编辑
减少偏离目标的效果
可以节省时间
使用多个sgRNAs可以增加所需的编辑并节省克隆选择时间2
许多研究人员认为,确定最有效的细胞转染方法是CRISPR工作流程中最困难的一步1。为了将基因编辑机器准确地传递到细胞中,转染条件需要对每种细胞类型进行广泛的优化。
干细胞、原代细胞、免疫细胞和造血细胞系更难转染,因为它们改变了细胞修复机制,降低了细胞活力。成功的转染通常取决于研究人员以前的经验和对所选细胞系内细胞特性的理解。
克隆选择虽然不是必不可少的,但却是开发含有所需敲除物的同质细胞群的最佳实践。浓缩减少了获得克隆种群所需的细胞传代次数,提高了下游实验中细胞种群的健康水平。
然而,这些阶段可能耗时且技术要求高,需要对多个克隆进行广泛筛选,以确定所需的淘汰。如果没有完全优化的生长条件,它可能会导致宝贵的细胞样本死亡,因此,在此过程中会损失所有工作。
一旦建立了CRISPR KO细胞系,对特定基因编辑进行充分验证是很重要的。为了确保下游的生存能力,这通常需要确定淘汰赛的特征。这可以通过表型作为初始指标来实现,但还需要分子技术来明确克隆的特征。DNA错配检测分析也可以在第一次通过时验证CRISPR-Cas9反应,但完整的DNA测序对于验证所有等位基因的敲除是否没有不必要的缺失至关重要。
如何验证CRISPR淘汰赛
通过多种方法进行验证可以确保基因编辑的准确性:
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