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SWITCH(化学物质相互作用时间和动力学的全系统控制)是一种简单、可扩展和可推广的组织处理方法,用于完整生物系统的蛋白质组成像。SWITCH组织处理和清除方法提供了对高维多尺度信息的访问,这些信息可能有助于了解从分子到细胞再到整个系统的健康和疾病。
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由钟实验室.
灌注溶液
该溶液应在灌注前立即新鲜,并始终放在冰上。建议在混合成分之前冷却所有单独的成分。
固定-关闭解决方案
使用HCl将一瓶PBS滴定至pH 3。在水中创建0.1 M HCl和0.1 M邻苯二甲酸氢钾(KHP)的溶液。最后,以2:1:1(pH 3 PBS):(0.1 M HCl):(0.1M KHP)的比例混合这些溶液。
向该溶液中添加GA储备溶液,使最终浓度为4%GA。确保该溶液始终保持低温。建议在添加GA之前冷却溶液。
固定-ON解决方案
向PBS(pH 7.4)中添加GA储备溶液,使最终浓度为1%GA。确保该溶液始终保持低温。建议在添加GA之前冷却PBS。
PBST公司
向PBS中添加TX-100至最终浓度0.1%(v/v)。此外,添加叠氮化钠至最终浓度0.02%(w/v)。
灭活溶液
向PBS中添加最终浓度为4%(w/v)的乙酰胺和最终浓度为4%(w/v)的甘氨酸。
热清除解决方案
向水中添加SDS至最终浓度200 mM,亚硫酸钠至最终浓度20 mM。该溶液应经常新鲜,因为亚硫酸盐在溶液中会随着时间的推移而降解。
DiD-OFF解决方案
向PBS中添加SDS至最终浓度10 mM。每200μL溶解1mg DiD粉末。此溶液应避光保存。注:如果需要其他激发/发射波长,可以使用类似于DiD的分子,只要分子具有足够的亲脂性。
抗体OFF溶液
向PBS中添加SDS至最终浓度0.5 mM。这最容易通过稀释SDS储备溶液来实现。当向该溶液中加入大比例抗体(例如,>1:10)时,应注意SDS浓度的变化。
光学清洗解决方案
该溶液由水中23.5%(w/v)N-甲基-D-葡聚糖、29.4%(w/v)二元甲酸和32.4%(w/v)碘羟烷醇组成。在每一步中使用搅拌棒(如有必要,可摇晃)使粉末完全溶解。混合溶液时不要加热,因为这会导致颜色变化。
该溶液应小心储存,以确保不会失水,因为只有少量蒸发会导致沉淀。特氟隆胶带可以用来增加瓶子密封的安全性,瓶盖周围可以使用副膜。
可能需要使用60%的碘克山诺溶液(见试剂清单),而不是碘克山醇粉末,因为价格不便宜。这种情况下的光学清除解决方案如下:
1a、。灌注
灌注是组织保存的首选方法。使用您选择的灌注技术
1b、。开关介导的组织保存
如果无法灌注,则必须使用SWITCH保存样品。
注:固定-OFF和-ON步骤的时间取决于样本大小,可能需要根据这些初始值逐个进行优化。我们发现,这些参数适用于厚度约为0.5–1.0 cm的人类样本库。
通过灌注或SWITCH固定后,必须在PBST中清洗样品,以去除未结合的固定分子。
注:如果需要切割样品,则应在清除样品之前立即进行切割。
灭活样品接下来必须在热澄清溶液中孵育,以洗去剩余的灭活溶液,并在样品中分配亚硫酸钠。
培养时间的长短取决于组织的大小。对于小鼠大脑切片,100µm切片大约需要两个小时,而整个小鼠大脑最多需要几天。重要的是,用户应定期检查进度,以确定正确的孵化时间长度。一般来说,如果样品放在网格或一些字母/标记上,那么当样品准备好时,您应该能够看到穿过它的黑线。
可以使用其他温度或持续加热的方法,但样品在较高温度下可能会随着时间的推移而变质。
注:如果样品中含有基因编码的荧光团、通过病毒注射等方式引入的荧光团,则可以在37˚C下清除样品以保持这种荧光。在这种低温下,清除过程将花费更长的时间,但高于此温度的温度将导致清除过程中失去荧光。
注意:在这种情况下,猎鹰管会随着时间的推移变得脆弱,因此有必要经常检查管道是否开始泄漏。
4a、。开关介导的有髓纤维标记
在样品被清除后,SWITCH介导的标记是可能的。亲脂性DiD荧光分子可以很容易地观察到髓鞘纤维。
我们还观察到,番茄凝集素和核染色剂(如DAPI或Syto16)可以与这种SWITCH方法一起使用。
4b、。开关介导的免疫标记
样品清除后,可以通过开关进行标记。
标记后,样品必须在折射率匹配溶液中平衡,以便于成像。
成像后,应使用热清洗液将光学清洗液从样品中清洗出来。
Murray,E.、Hun,J.、Goodwin,D.、Ku,T.和Swaney,J.简单、可扩展的蛋白质组成像用于完整系统的高维分析。细胞1631500–1514(2015)。