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将新鲜的含有以下混合物的裂解缓冲液中感兴趣的细胞或组织均匀化蛋白酶抑制剂(和磷酸酶抑制剂处理磷酸化蛋白质时)。一旦发生水解,蛋白质水解、去磷酸化和变性就开始了。如果样品始终保存在冰上或4°C下,并将适当的抑制剂新鲜添加到裂解缓冲液中,则这些事件可以大大减缓。使用RIPA或NP40缓冲液补充新鲜蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒.
在调查磷酸化事件时,记得在购买的鸡尾酒中添加磷酸酶抑制剂。
保持蛋白质处于磷酸化状态!添加足够的磷酸酶抑制剂,并始终将样品放在冰上。在5%w/v BSA(fractionV)NOT MILK中封闭膜(牛奶中含有酪蛋白,酪蛋白是一种磷酸蛋白;由于磷酸特异性抗体检测牛奶中的酪蛋白,这会导致高背景值)。记住,可能需要诱导磷酸化。低信号或无信号可能意味着感应不足。用样品进行推荐的阳性对照。
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