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以下是培养细胞系的一般指南。所有细胞培养必须在微生物安全柜中使用无菌技术进行,以确保无菌。
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发动机罩规定
高压灭菌
所有培养基、补充剂和试剂必须无菌,以防止细胞培养中的微生物生长。如果某些试剂和补充剂未经消毒,则需要对其进行过滤器消毒。
观看我们的无菌技术视频协议 有关避免污染的详细指南。
开始工作之前,请检查细胞系提供的信息,以确定应使用的介质类型、添加剂和建议。
大多数细胞系可以使用DMEM培养基或含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI培养基生长,如果需要,可以添加2 mM谷氨酰胺和抗生素(见下表)。
在开始培养之前,请检查哪些培养基和培养基补充了您所使用的细胞系。培养基和补充剂应无菌。尽可能购买无菌试剂,仅在无菌条件下使用培养箱,以确保其保持无菌。
使用DMEM介质的一般示例
大多数细胞系将在培养瓶上生长,而不需要特殊基质等。然而,一些细胞,特别是原代细胞,将需要在特殊基质上生长,如胶原蛋白,以促进细胞附着、分化或细胞生长。我们建议查阅相关文献,了解有关培养细胞的更多信息。
以下是内皮细胞和上皮细胞的示例:
对于人体细胞,用1%明胶覆盖烧瓶。或者,对于其他类型的细胞,如BAEC,烧瓶可以涂有1%的纤维粘连蛋白。
细胞应每天进行显微镜检查,以监测健康状况、生长速度和汇合(细胞单层覆盖的表面积百分比)。
粘附细胞应主要附着在烧瓶底部,呈现粘附形态(取决于细胞系),并在其膜周围折射光线(参考Abcam细胞系数据表图像)。
悬浮细胞应呈现圆形形态,并在其膜周围折射光线。一些悬浮细胞可能结块(可以添加解离试剂,如Pluronic PF68,以促进结块去除)。
含有酚红的介质的颜色应为粉红色/橙色(介质颜色可能因CO而变化2环境)。对于成像应用,可以使用不含酚红的介质,避免干扰成像采集。培养基的淡黄色表示酸性和pH值降低,这通常与污染或不健康细胞有关。
在以下情况下丢弃单元格:
也称为细胞分裂和细胞传代。
分割比率或播种密度可用于确保细胞在特定日期准备好进行实验,或维持细胞培养以供将来使用或作为备份。悬浮细胞系根据体积播种,因此播种密度将按细胞/mL计算,而粘附细胞系根据烧瓶表面积播种,因此将按细胞/cm计算2。细胞系通常需要特定的播种密度,因此请始终检查所用细胞系的指南。如果使用高分裂比,生长缓慢的细胞可能不会生长。快速生长的细胞可能需要较高的分裂比,以确保它们不会过度生长。
粘附细胞系可以使用细胞系特定的分裂比或播种密度(细胞/厘米2):
分流比基于烧瓶表面积,例如:
1 x 25厘米2烧瓶分体式1:3将产生3 x 25 cm2烧瓶或1 x 75厘米2
悬浮细胞系应使用细胞系特定的接种密度(细胞/mL)进行维护:
如果细胞需要长时间无人看管(即银行假日周末),建议使用低于正常播种密度/分割率的细胞。
当细胞约80%汇合(烧瓶表面80%被细胞单层覆盖)时,细胞仍应处于其生长的对数阶段,需要进行继代培养。不建议让细胞过度汇合,因为这可能会对基因表达和细胞生存能力产生负面影响。
注意——并非所有细胞都需要胰蛋白酶化,对某些细胞来说可能有毒。它还可以诱导一些膜蛋白的暂时内化,这在计划实验时应该考虑。在这种情况下,通常可以使用其他方法,如温和的细胞刮除或使用非常温和的清洁剂。
如有必要,可重复一次或两次(一些细胞株需要很长时间才能进行胰蛋白酶化,而这些细胞需要更多的洗涤以去除任何残留的FBS以帮助胰蛋白酶化)
如果细胞在几天内生长良好,但尚未融合,则需要更换培养基以补充营养并保持正确的pH值。细胞产生积极的促生长因子,并将其分泌到培养基中,因此,进行一半的培养基更换有助于补充培养基提供的营养,并保持这些积极的生长因子。
要更换培养基,请使用水浴或培养箱在37°C下加热培养基至少30分钟。从烧瓶中吸取旧培养基,并用必要体积的新鲜预加热培养基替换培养基,然后返回培养箱。
传代数是细胞经过亚培养的数量。应记录通道号,不要过高。这是为了防止使用经历遗传漂变和其他变异的细胞。