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检测细胞内或细胞外蛋白质的一般程序流式细胞术.
2023年7月17日更新。
首先,我们应该采集我们的细胞或组织,并准备一个单细胞悬浮液。然后,我们将单细胞悬浮液转移到96个平板、试管或聚苯乙烯圆底管中,具体取决于所使用的细胞数量和体积。
当染色细胞内靶点时,我们必须进行额外的固定和渗透步骤。固定是保持细胞内蛋白质结构所必需的。渗透破坏细胞膜,使抗体进入细胞并染色细胞内靶点。
当染色细胞外靶点时,我们将立即进行阻断步骤。当同时分析细胞内和细胞外靶点时,我们将在固定和渗透之前进行细胞表面染色(见第5阶段)。
为细胞内染色选择合适的固定和渗透方法的有用提示:
所需材料:
所需时间=约1小时15分钟。
阻断蛋白质和Fc结构域对于防止抗体与细胞的非特异性结合至关重要。
所需时间=约45分钟。
用清洗缓冲液清洗细胞两次。
旋转细胞(200 g,5分钟,4°C),去除上清液,每次清洗后重新悬浮颗粒。提示: 清洗步骤的数量、旋转时间和速度可能需要优化。当使用多余的清洗缓冲液并在离心后尽可能多地去除液体时,一个清洗步骤就足够了。
继续进行抗体培养。
我们现在准备用荧光结合抗体染色细胞,以便在流式细胞仪中进行间接或直接检测。
还可以重复以下步骤并对其进行调整多色流式细胞术其中针对不同的靶点使用多组荧光结合抗体。当使用多组抗体时,我们应该尽量减少荧光团发射光谱中的任何重叠。
时间=约40分钟。
间接标记需要两个孵育步骤,首先使用一级抗体,然后使用兼容的二级抗体。二级(而非一级)抗体具有荧光染料(FITC、PE、Cy5®等)共轭的。
时间=约1小时15分钟。
抗体培养后,我们可以在流式细胞仪上进行实验。该程序在很大程度上取决于所使用的设备,因此首先应咨询制造商。
有关荧光补偿、选通策略、控制和可视化方法的详细讨论,请参阅我们的流式细胞术应用指南.
当表面染色的细胞是活的且未固定或渗透时,可以使用荧光激活细胞分选(FACS)将其分离。利用FACS,可以根据活细胞的特性将其分为不同的群体。然后,我们可以对分离的细胞进行下游分析。
有关更多信息,请查看我们的免费在线流式细胞术培训旨在帮助您从细胞中获取尽可能好的数据。