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可以使用以下两种方法之一固定电池:
细胞应使用冰镇PBS清洗三次。
当细胞在抗原回收缓冲液中加热时,某些抗体的效果最佳。检查产品信息,以获取针对所使用的每种初级抗体的建议。
如果靶蛋白是细胞内的,那么使细胞渗透是非常重要的。甲醇固定样品不需要渗透。
为了检查同一样本中两种(或更多)不同抗原的共同分布,使用双重免疫荧光程序。这可以同时(在混合物中)或顺序(一个抗原接一个抗原)进行。
确保你有针对不同物种的抗体及其相应的二级抗体。例如,针对抗原A的兔抗体,针对抗原B的鼠抗体。或者,您可以使用直接偶联到不同荧光团的一级抗体。
如果您必须检测两种以上的抗原,请继续执行步骤1-5以检测其余的抗体。
A.用Alexa Fluor标记的Annexin V®488英寸IHC冷冻大鼠胎盘切片(免疫组织化学)。 绿色-抗膜联蛋白V抗体[EPRO3980](Alexa Fluor®488) (大约201540);红色-抗管蛋白抗体[YOL1/34](Alexa Fluor®647)(约195884年);蓝色-DAPI公司。
B.标有Alexa Fluor的拉明B1®488在HUVEC细胞中使用 Alexa Fluor公司®488-结合二级抗体. 绿色-抗-Lamin B1抗体(约16048),二级抗体山羊抗狂犬病IgG H&L(Alexa Fluor®488) (约150077);红色-抗α-管蛋白抗体(约7291),二级抗体山羊抗鼠IgG H&L(Alexa Fluor®647) (约150115); 蓝色-DAPI公司。
查看的优点用于ICC/IF的Alexa Fluor®二级抗体
免疫细胞化学(ICC)是一种利用抗体可视化单个细胞内特定蛋白质定位的技术。本视频概述了悬浮细胞制备载玻片,然后进行固定、渗透、阻断和抗体培养。在从培养箱中取出细胞之前,组装细胞胞浆设备。
胞浆将悬浮细胞的薄层制剂沉积在载玻片上。加载电池并使其运行。应针对每种电池类型优化电池密度、加载体积和旋转速度。例如,较大的单元需要较慢的速度。小心卸载载玻片并将其放在载玻片托盘中干燥。。。然后转移到滑架上。
理想情况下,应立即固定电池。因此,将载玻片架放入固定剂罐中,孵育5-10分钟。接下来,将载玻片依次转移到两罐磷酸盐缓冲盐(PBS)中进行清洗。
一旦固定,它们可以在冰箱中储存一小段时间,但要保持湿润。使用的固定剂类型和固定时间需要优化。最常用的固定剂是多聚甲醛和甲醇。然而,最好检查您打算用于指导的主要抗体的数据表。
从支架上取下载玻片,敲掉多余的PBS。用PAP笔在细胞周围画一个疏水屏障。这将使试剂聚集在细胞上的一小滴中。重要的是要确保细胞在此过程中不会变干。小心地用移液管将渗透缓冲液移到细胞上,并孵育五分钟。
渗透步骤允许抗体进入细胞内表位,需要根据细胞类型、抗原和预期抗体进行优化。
可以使用许多不同的渗透剂。例如,Triton X-100,对于非常温和的渗透性,Tween-20。如果电池之前固定在甲醇中,则无需渗透。
细胞渗透后,从载玻片上取下多余的缓冲液,用磷酸盐缓冲盐加吐温-20,PBST在摇床上清洗5分钟。使用新鲜PBST重复上述步骤,总共进行三个洗涤步骤。清洗完成后,将载玻片放在洗涤缓冲液中,以免它们变干。
在冲洗幻灯片时,将一些纸巾弄湿,然后用它来排列幻灯片托盘。这将有助于在下一步中保持幻灯片湿润。去掉幻灯片上多余的缓冲区,重新绘制PAP笔圈,因为它们可能已经被部分冲洗掉了。
为了防止非特异性抗体结合,需要阻断细胞。在这种情况下,细胞在10%血清和1%牛血清白蛋白(BSA)中在室温下封闭一小时。阻塞缓冲区的类型和培养时间应针对您的实验进行优化。
注:;如果细胞已经在多聚甲醛中固定,通常在封闭之前用甘氨酸清洗,以熄灭任何残留的固定剂。理想情况下,封闭缓冲液中的血清种类应与二级抗体的培养种类相匹配,以避免任何交叉反应。
当细胞处于封闭缓冲液中时,制备初级抗体。阻塞后,细胞需要像以前一样在PBST中清洗三次五分钟。去除多余的洗涤缓冲液,重新擦洗PAP笔圈,因为它们可能已经部分洗掉。
将载玻片放在直线载玻片托盘中,并添加初级抗体溶液。每次做一张幻灯片,以避免干燥。在托盘上盖上盖子,小心地将其转移到冰箱中孵育一夜。
在PBST中清洗载玻片三次五分钟,以去除任何未结合的一级抗体。如果一级抗体没有直接结合,在室温下用二级抗体培养细胞一小时。核污渍,如赫斯特也可以包括在这一点上。然后在PBST中再次清洗载玻片三次。
轻敲第一张幻灯片上多余的缓冲区,然后放在幻灯片托盘上。最好一次处理一张幻灯片,以避免干燥。在电池上添加一滴兼容的安装介质,确保不会产生气泡。
使用一把镊子将盖子滑到安装介质上,使液体逐渐扩散。避免对幻灯片施加任何压力,因为这可能会损坏您的细胞。幻灯片现在可以使用共焦显微镜或者可以在冰箱里储存很短时间。