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2023年7月21日出版。
在此处下载完整的流式细胞仪指南。
虽然流式细胞术是同时识别和分析多种抗原的有力工具,但增加抗原和荧光团的数量也增加了实验设计的复杂性。
一旦你知道你想研究哪些抗原,你就需要建立你的小组。通常,这是建立多色流式细胞术实验最具挑战性的方面。以下步骤旨在提供一个快速、简单的指南,帮助您完成该过程1.
在设计多色流动面板之前,您需要确定以下因素:
您只能使用由激光器发出的相应波长的光激发的荧光团(图1)。
图1。流式细胞术中常用的激光。
荧光灯的发射波长也应与可用的滤光片及其允许通过的波长相匹配。荧光灯的相对亮度及其激发和发射光谱可以使用我们的荧光图进行检查。
请参阅您的仪器手册或与您的核心设施经理交谈,以确保最佳检测。
由于功能差异和细胞激活水平,一些细胞群体很少,或抗原密度较低。
高表达的抗原通常会被检测出来,并用几乎所有的荧光团从阴性对照中分离出来。通常,在设计多色流式细胞仪面板时,使用最亮的荧光团(如PE或APC)来检测低或未知抗原表达目标或罕见细胞群(图2),使用较暗的荧光团来检测更高丰度的目标。
图2。以较低密度表达的抗原可能需要较亮的PE或APC结合物提供较高的信号背景比,以便将阳性细胞与未染色细胞充分分离。
请记住,其他因素,例如样品缓冲液pH值,可能会影响荧光团亮度。由于激光器和滤波器组合的不同,相对荧光强度也取决于仪器。确保使用合适的FACS仪器来检测荧光灯。
为了获得多色流式细胞术的最佳结果,请选择发射光谱之间很少或没有重叠的最亮荧光团(图3)。补偿可用于控制光谱重叠的影响(见下文),但为了避免溢出,牺牲一个检测器中的一些亮度是值得的(表1)。
图3。在可能的情况下,选择发射光谱几乎没有重叠的荧光团。
表1。流式细胞术中良好和较差的荧光色素组合示例。
荧光团的发射光谱通常有一些重叠,如下面PE和FITC的例子所示。这种重叠会产生假阳性信号,因为可以在单个通道中检测到来自多个荧光团的荧光。光谱重叠在多色实验中可能存在问题。因此,必须使用补偿进行校正,以确保检测到的荧光真正来自被测荧光团2.
补偿前
在用蓝色激光(488 nm)激发后,FITC发射主要在FITC特定的通道中检测到,但发射尾位于用于检测PE的滤波器的范围内。这些在PE通道中被视为假阳性信号,这意味着FITC阳性的细胞对PE呈阳性(图4)。
图4。由于光谱重叠,FITC产生假阳性PE信号。
补偿后
为了进行补偿,只需要用FITC-标记抗体染色的样品。然后可以调整设置,直到PE通道中看不到FITC信号。补偿后,FITC发射仅在FITC的特定信道中检测到(图5)。
图5。补偿消除了光谱重叠引起的假阳性信号。
多色流式细胞术中应用补偿的提示和技巧
设置正确荧光补偿的程序遵循任何细胞仪上的相同基本原理。然而,由于仪器之间存在细微差异,我们始终建议查看制造商的说明。以下是一些有用的原则:
每个荧光灯都需要补偿控制,并且应该包含阳性和阴性群体。应遵循以下准则:
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