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CLARITY是一种将完整组织转化为纳米孔 水凝胶混合形式(交联的亲水性聚合物的三维网络),完全组装但具有光学透明性和高分子渗透性。CLARITY可实现完整组织原位杂交免疫组织化学和抗体标签这样可以对临床样本进行精细的结构分析,其形式适合于探索生理功能和疾病的基础。
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由钟实验室.
组织清除指南、试剂盒和试剂
了解其他组织清除方法,组织清除成功的建议,以及易于使用的组织清除工具组织清理指南.
原则上,可以使用任何年龄段的任何动物的任何组织类型,无论是否带有荧光。在上一篇论文中1,我们证明CLARITY与整个成年小鼠大脑、整个成年斑马鱼大脑和广泛固定福尔马林的死后人脑切片兼容(本例中无灌注步骤和进一步优化)。
具有强荧光蛋白表达的组织可以经历本方案中描述的CLARITY处理,然后可以直接成像;没有荧光蛋白的组织可以用抗体或RNA探针标记1用于后续成像。
水凝胶单体溶液
将所有试剂置于冰上,通过将1g偶氮引发剂溶解在10mL超纯水中,制备10%的引发剂溶液储备溶液。然后准备以下溶液:
对于正在处理的每个组织样品,需要80 mL。始终先加水以保持其他成分稀释,然后按此处列出的顺序添加试剂。溶液可在-20°C下无限期储存。
小心:确保始终将所有试剂和最终溶液放在冰上。水凝胶聚合反应是由热引发的。
SDS清洗液
使用硼酸将以下溶液调节至pH 8.5。
使用1X PBS配制含有0.1%Triton-X和0.1%叠氮化钠的溶液。
光学清洗液(PROTOS)
该溶液由水中23.5%(w/v)N-甲基-D-葡聚糖、29.4%(w/v)二元甲酸和32.4%(w/v)碘羟烷醇组成。在每一步中,使用搅拌棒(必要时摇晃)将粉末完全溶解。混合溶液时不要加热,因为这会导致颜色变化。
该溶液应小心储存,以确保不会失水,因为只有少量蒸发会导致沉淀。特氟隆胶带可以用来增加瓶子密封的安全性,瓶盖周围可以使用副膜。
可能需要使用60%的碘克山诺溶液(见试剂清单),而不是碘克山醇粉末,因为价格不便宜。这种情况下的光学清除解决方案如下所示:
*(为了实现这一点,向每10 mL 60%碘克沙醇溶液中添加约2.75 mL水)注:试剂应按顺序添加
水凝胶组织杂交
ETC系统
灌注和组织制备
21)小心地将样品放在Blu-Tack片之间,并向样品中加入约20μL的光学清洁溶液。
22)唇边朝上,用力将Willco盘子向下压到粘合剂上,直到它刚好接触到样品。使用吸管,向粘合剂之间的间隙添加更多光学清洁溶液,直到成像室填满。
23)KWIK-SIL是一种快速固化的粘合剂。小心地将其添加到Blu-Tack之间的间隙中,以构建墙并密封样品。注意不要引入任何气泡,并确保腔室完全充满光学清洁溶液。
24) 用铝箔覆盖此结构,并将其安全存放以进行固化。大约20分钟后,样品就可以成像了。
1.Chung,K.等人。完整生物系统的结构和分子询问。《自然》497332-7(2013)。