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真核染色质是DNA和相关组蛋白的复合体,参与DNA到染色体中的高级包装。给定DNA序列的染色质状态影响转录活性和复制时间,并受DNA和组蛋白潜在可逆共价修饰的调节。
柔性N末端尾部内保守赖氨酸和精氨酸残基的组蛋白修饰,如磷酸化、乙酰化和甲基化,指定了一个作为与染色质相关蛋白特定结构域交互平台的代码。
交联染色质与特定组蛋白修饰特异性抗体的免疫沉淀(IP)(染色质免疫沉淀,ChIP),然后进行PCR以检测IP组分中感兴趣的DNA序列的潜在富集或缺失,这是一种优雅而直接的查询单个基因特定染色质状态的方法,已经在许多实验室中常规使用。
然而,与动物细胞不同的是,植物细胞的细胞壁是刚性的,这限制了对动物协议的简单使用。在本方案中,所述方法用于研究植物模型生物体中的组蛋白修饰拟南芥本协议是劳伦斯及其同事发布的原始程序的改编版(劳伦斯等人,2004年)。
本协议描述了如何从拟南芥中制备染色质,随后可用于染色质免疫沉淀(ChIP)。在开始X-ChIP测定之前,应确定确切的染色质浓度。查看我们的交联染色质免疫沉淀(X-ChIP)协议,应在下文详述的染色质制备后使用。
将拟南芥种子在4°C的0.1%Phytablend w/v中分层48小时,然后播种到土壤上。每个染色质制剂使用1.5克完整的3-4周龄幼苗。在收获期间,必须尽可能避免土壤污染。
染色质交联
染色质制备
将冷却的台式离心机以13000 rpm转速旋转10分钟。将上清液添加到新的Eppendorf管中。
重复步骤14。取下10µl在琼脂糖凝胶上运行。
在1.5%w/v琼脂糖凝胶上分离步骤12和15的等分样品。在经过声波处理的样品中,DNA应该发生位移,与未经处理的样品相比强度更大,范围在200-2000 bp之间,以500 bp为中心。
按照步骤16,染色质样品可以在液氮中“snap冷冻”并在-80°C下储存。然而,应避免重复的冷冻/解冻循环。
预清除和免疫沉淀(IP)
免疫复合物的收集、洗涤和洗脱
反向交联
DNA清理
提取缓冲液1
40万蔗糖10 mM Tris-HCl,pH 8.010 mM氯化镁25 mMβ-巯基乙醇蛋白酶抑制素
提取缓冲液2
0.25 M蔗糖10mM Tris-HCl,pH 8.010 mM氯化镁21%w/v Triton X-1005 mMβ-巯基乙醇蛋白酶抑制素
提取缓冲液3
170万蔗糖10 mM Tris-HCl,pH 8.02 mM氯化镁20.15%w/v Triton X-1005 mMβ-巯基乙醇蛋白酶抑制素
核裂解缓冲液
50 mM Tris-HCl,pH 8.010 mM乙二胺四乙酸二乙酯1%w/v十二烷基硫酸钠蛋白酶抑制素
蛋白酶抑制剂
1 mM PMSF(最终浓度)蛋白酶抑制剂混合物(遵循制造商的说明)
CHIP稀释缓冲液1.1%Triton®声波风廓线仪X-1001.2 mM乙二胺四乙酸二乙酯16.7 mM Tris-HCl,pH 8.0167 mM氯化钠
洗脱液1%十二烷基硫酸钠10万NaHCO三
低盐洗涤缓冲液150 mM氯化钠0.1%十二烷基硫酸钠1%Triton®声波风廓线仪X-1002 mM乙二胺四乙酸二乙酯20 mM Tris-HCl,pH 8.0
高盐洗缓冲液500 mM氯化钠0.1%十二烷基硫酸钠1%Triton®声波风廓线仪X-1002 mM乙二胺四乙酸二乙酯20mM Tris-HCl,pH 8.0
氯化锂清洗缓冲液0.25百万氯化锂1%Nonide P-401%脱氧胆酸钠1 mM乙二胺四乙酸二乙酯10 mM Tris-HCl,pH 8.0
TE缓冲器10 mM Tris-HCl,pH 8.01 mM乙二胺四乙酸二乙酯