ChIP是一种听起来很吓人的技术,但使用正确的工具可以掌握它。 如果ChIP在您的实验室中不是一种成熟的技术,您可以考虑使用工具包,例如 ChIP试剂盒ab500 .
你感兴趣的相互作用离DNA越远,没有交联的ChIP就越不有效。 组蛋白修饰的ChIP不太可能需要交联,而非组蛋白如转录因子和DNA结合复合物中的蛋白质可能需要交联。
甲醛是一种非常好的DNA-蛋白质交联剂,但由于其尺寸较小(2μl),它不是一种非常有效的蛋白质交联剂。 因此,不直接与DNA结合的ChIP蛋白通常是困难的。
始终进行时间过程实验以优化交联条件。 我们建议将样品交联2–30分钟。 添加甘氨酸以淬灭甲醛并终止交联反应。
无论您使用什么方法,每次设置实验时都要确保运行碎片化时间过程。
酶切不会产生随机的染色质片段。 微球菌核酸酶倾向于基因组序列的某些区域而不是其他区域,并且不会均匀或同等地消化DNA。 结果可能并不完全准确,因为某些基因座可能被过度表示,一些数据可能会丢失。
在进行N-ChIP时,应进行X-ChIP作为对照实验,以评估由于缺乏交联而导致的任何动态和不必要的变化。
虽然超声处理最适合X-ChIP,酶消化对完全交联的样品无效,但当需要温和或不完全交联时,微球菌核酸酶消化可能有用,它可以与超声处理结合提高分辨率。
避免起泡,因为这会导致溶液内能量传递的减少,并会降低超声处理效率。
超声染色质可以在液氮中快速冷冻,并在-80°C下储存长达2个月。 避免多次冻融循环。
即使是完整的表征也无法告诉你抗体是否会在X-ChIP中发挥作用,因为交联的影响可能是巨大的,可能会产生不同的表位,并可能丢失特定的表位。 为了测试未经特征化的抗体是否能产生ChIP,您可以使用抗体进行ChIP,然后使用相同的抗体进行免疫印迹。
请记住,这些抗体本身并不是阳性和阴性对照,因为这取决于您正在研究的位点:如果特定的感兴趣位点没有H3K4me3, 世界上最好的抗H3K4me3 ChIP-grade抗体不会从该区域产生任何免疫沉淀,因此不会成为合适的阳性对照。 作为阴性对照,使用识别非染色质表位的抗体,如抗GFP抗体。
染色质重塑可能移动或移除特定位点(例如活性启动子)的组蛋白,因此使用针对非修饰组蛋白(例如组蛋白H3)的对照抗体检查特定基因组位点的核小体保存情况。
分析组蛋白修饰时,需要将其归一化为组蛋白含量。 这可以通过抗H3抗体实现( 公元1791年 ).
即使抗体能够免疫沉淀甲醛固定染色质中感兴趣的蛋白质,这并不意味着ChIP实验有效,因为您感兴趣的蛋白可能没有与DNA交联。
如果观察到高背景,可能需要额外清洗。 或者,在免疫沉淀之前,也可以通过与蛋白A/G珠孵育1小时来预先清除超声染色质。 在这一额外步骤中,将去除珠子上的任何非特异性结合。
衡量起始材料的数量(和质量)是有效解释结果的关键。
不要在高转速下离心分离珠子(不要超过6000 rpm),因为这样会压紧珠子并损坏珠子。
一些抗体受到相对低浓度SDS的影响。