Fura2AM在运动神经元钙显像中的应用

一个详细的协议与技巧和技巧如何使用钙中的FurA-2 AM从腹侧脊髓运动神经元成像。


1。培养贴壁细胞-腹侧脊髓(13日龄小鼠胚胎)的运动神经元富集培养物

  • 运动神经元和神经胶质细胞通过离心在6.2% OpTiPREP垫上纯化。
  • 将神经胶质细胞涂布在聚L-鸟氨酸(硼酸盐缓冲液中的1 mg/ml)上涂覆12 mm的皿(MielnFeld GMH & Co. KG,德国),密度为50000细胞/皿,在DMEM/HAM的F12培养基中补充胎牛血清(10%),第1周,之后用马血清(10%)和青霉素(10 U/ml)/链霉素(10μg/ml)。
  • 运动神经元富集组分接种在这些预先建立的神经胶质饲养层,密度为30000个细胞/皿用于钙成像实验。
  • 培养物在37℃的5%共加湿培养箱中保存,用于第13天开始的实验。在体外。


2。溶解呋喃2

  • 溶解呋喃-2直接使用DMSO在瓶内(最终浓度为2毫米)。
  • 用铝箔保护光线。
  • 等分为2 L,储存在黑暗中。注意:小心小体积会褪色更快。


三。向你的细胞添加Fura-2 AM

  • 将每500 L L的2μL呋喃2AM溶解(最终浓度为8μm)=FurA-2 AM直接加入运动神经元培养基中,由神经基础培养基、B27神经合剂(2%)、N2补充剂(0.2%)、L-谷氨酰胺(1 mm)、马血清(2%)、青霉素(10 U/ml)/链霉素(10μg/ml)和脑源性神经营养因子(2 ng/ml)组成。
  • 提示:预热等温线(只用手上的热量),否则它不会溶解,你可以在成像过程中看到小的亮染料聚集体。


4。孵卵

  • 将细胞放回培养箱,孵育20分钟。


5。取出盖玻片并转移到成像装置

  • 将盖玻片置于含有NaOH(HMM)11.6、NaCl 129.1、KCl 5.9、葡萄糖11.5、MgCl 1.2、CaCl 3.2的标准培养液中的小培养皿中,并用pH值调节至pH 7.4。(这已经洗过盖玻片了。)
  • 确保所有的解决方案都是预热的。


6。图像单元

  • 将盖玻片放在成像室中,继续用细胞外液灌注(见上文)。
  • 通过在350 nm和380 nm(5毫秒曝光)交替激发的图像单元,通过LP 440滤波器收集光。
  • 自发的钙波可在神经胶质细胞中经常见到。
  • 运动神经元也表现出自发的钙瞬变,但只有当神经元网络是非常密集的。
  • 运动神经元显示钙瞬变刺激后,红藻氨酸,AMPA受体激动剂。


参考

这项协议是由Janin Lautenschl博士提出的。欲了解更多信息,请参阅劳特施勒格等。Exper-NoRL 2013,PMED:23578819.


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