Fura2AM在运动神经元钙显像中的应用

1。培养贴壁细胞-腹侧脊髓（13日龄小鼠胚胎）的运动神经元富集培养物

• 运动神经元和神经胶质细胞通过离心在6.2% OpTiPREP垫上纯化。
• 将神经胶质细胞涂布在聚L-鸟氨酸（硼酸盐缓冲液中的1 mg/ml）上涂覆12 mm的皿（MielnFeld GMH & Co. KG，德国），密度为50000细胞/皿，在DMEM/HAM的F12培养基中补充胎牛血清（10%），第1周，之后用马血清（10%）和青霉素（10 U/ml）/链霉素（10μg/ml）。
• 运动神经元富集组分接种在这些预先建立的神经胶质饲养层，密度为30000个细胞/皿用于钙成像实验。
• 培养物在37℃的5%共加湿培养箱中保存，用于第13天开始的实验。在体外。

2。溶解呋喃2

• 溶解呋喃-2直接使用DMSO在瓶内（最终浓度为2毫米）。
• 用铝箔保护光线。
• 等分为2 L，储存在黑暗中。注意：小心小体积会褪色更快。

三。向你的细胞添加Fura-2 AM

• 将每500 L L的2μL呋喃2AM溶解（最终浓度为8μm）＝FurA-2 AM直接加入运动神经元培养基中，由神经基础培养基、B27神经合剂（2%）、N2补充剂（0.2%）、L-谷氨酰胺（1 mm）、马血清（2%）、青霉素（10 U/ml）/链霉素（10μg/ml）和脑源性神经营养因子（2 ng/ml）组成。
• 提示：预热等温线（只用手上的热量），否则它不会溶解，你可以在成像过程中看到小的亮染料聚集体。

4。孵卵

• 将细胞放回培养箱，孵育20分钟。

5。取出盖玻片并转移到成像装置

• 将盖玻片置于含有NaOH（HMM）11.6、NaCl 129.1、KCl 5.9、葡萄糖11.5、MgCl 1.2、CaCl 3.2的标准培养液中的小培养皿中，并用pH值调节至pH 7.4。（这已经洗过盖玻片了。）
• 确保所有的解决方案都是预热的。

6。图像单元

• 将盖玻片放在成像室中，继续用细胞外液灌注（见上文）。
• 通过在350 nm和380 nm（5毫秒曝光）交替激发的图像单元，通过LP 440滤波器收集光。
• 自发的钙波可在神经胶质细胞中经常见到。
• 运动神经元也表现出自发的钙瞬变，但只有当神经元网络是非常密集的。
• 运动神经元显示钙瞬变刺激后，红藻氨酸，AMPA受体激动剂。

参考

这项协议是由Janin Lautenschl博士提出的。欲了解更多信息，请参阅劳特施勒格等。Exper-NoRL 2013，PMED：23578819.