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使用膜联蛋白V-FITC染色和选择性碘化丙啶(PI)早期检测细胞凋亡的程序。
审查日期:2021年11月11日
下载或打印此协议。
细胞表面磷脂酰丝氨酸(PS)残基(通常隐藏在质膜中)的暴露是细胞凋亡的早期事件,可用于检测和测量细胞凋亡。在细胞凋亡过程中,PS从质膜的细胞质表面转移到细胞表面。Annexin V对PS具有较强的钙依赖性亲和力,因此可以用作检测细胞凋亡的探针。
这是一个协议示例根据中提供的协议,使用Annexin V进行PS暴露检测Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(ab14085). 请注意,在使用特定套件时,您应始终使用数据表中提供的协议,因为它是为获得最佳产品效果而设计的。
1.1 诱导细胞凋亡通过期望的方法。
1.2收集1–5 x 105细胞离心。
1.3将细胞重新悬浮在500µL的1X Annexin V结合缓冲液中。
1.4 添加5µL膜联蛋白V-FITC和5µL碘化丙啶(PI,可选)。
1.5 在室温下黑暗培养5分钟。
备选方案:对于粘附细胞,在用膜联蛋白V-FITC孵育之前,用含有血清的培养基轻轻胰蛋白酶化并清洗细胞一次(步骤1.3-1.5)。
1.6根据分析方法,转至下面的B或C。
2.1通过分析annexin V-FITC绑定流式细胞术(Ex=488 nm;Em=350 nm),使用FITC信号检测器(通常为FL1)
2.2如果添加碘化丙啶,则使用藻红蛋白发射信号检测器(通常为FL2)分析PI染色。
3.1将第1.5阶段的细胞悬浮液放在玻璃载玻片上。用玻璃盖玻片盖住试管。
备选方案:为了分析粘附细胞,直接在盖玻片上培养细胞。
3.2培养后(阶段1.5)将盖玻片倒置在玻片上,使细胞可视化。细胞也可以用1X Annexin V结合缓冲液清洗,并在可视化之前固定在2%的甲醛中。
提示:固定前,细胞必须与Annexin V-FITC孵育,因为任何细胞膜破裂都可能导致Annexin-V与细胞膜内表面PS的非特异性结合。
3.3使用FITC和罗丹明双过滤器组在荧光显微镜下观察细胞:
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