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考虑到细菌和哺乳动物表达之间的差异。
重组蛋白广泛应用于生物和生物医学研究。每一位使用外部来源蛋白质的研究人员都知道获得纯净、高质量、无污染、批次间一致性高的产品的重要性——这些属性对于获得可靠和可重复的结果至关重要。然而,在评估制造商的蛋白质质量时,经常忽略的是所使用的表达系统。
商业化的蛋白质生产成功地将许多生物体作为跨王国的表达系统:细菌、植物、真菌、昆虫或哺乳动物细胞系,包括人类。
如果你的研究兴趣是细菌,那么买一种细菌产生的蛋白质是有道理的。但是如果你进行人体研究,要小心——许多人类来源的蛋白质是在细菌系统中商业化生产的,这意味着它们不会被正确折叠或改性,因此,它们的功能不会像它们的本地同类一样,也不会像它们那样稳定。这会使研究结果不太适用于真实的临床环境。
“哺乳动物表达系统具有细胞机制,以确保商业蛋白质中的PTM(翻译后修饰)与人体中表达的相同蛋白质中的相同PTM(译后修饰)完全相同,但这种机制根本不存在于原核系统中。正确的PTM也有助于蛋白质正确折叠,”英国Abcam剑桥生物医学校区蛋白质科学主管Gráinne Dunlevy博士解释道,他也是Abcam在中国杭州的研究机构的负责人。“如果您的检测需要一种功能性的、来源于人类的天然蛋白质,那么细菌表达的等效蛋白质很可能无法正常工作,您必须添加更多的蛋白质。”
简单地说,在体内,编码基因的核DNA被转录成mRNA,翻译成多肽,折叠成蛋白质的3D结构,这既受固有氨基酸属性的驱动,也受自然环境诱导的PTM。产生的功能蛋白被分泌或运输到其最终目的地。1
在实验室中,通过克隆载体将编码目标蛋白的DNA构建物转染到生物表达系统中,并将生成的蛋白分泌到培养基中。然后使用亲和柱捕获、纯化并分析其纯度和功能性。2,3尽管转录和翻译在各个王国之间是相似的,但折叠和PTM不同,并且在很大程度上取决于表达物种的本地环境和细胞解剖。
在哺乳动物细胞中,折叠发生在内质网中,内质网是细菌细胞中不存在的一种结构,它含有酶和氧化环境,有助于正确折叠、二硫键形成和N-连接糖基化。4然后,一种用于分泌的蛋白质将进入高尔基体(仅在真核生物中发现),在那里可能发生O-连接的糖基化(图1)。4
如果一种蛋白质没有正确折叠并且没有天然的PTM,那么它就不具有功能,甚至不稳定,这就是为什么更大、更复杂的蛋白质最好使用哺乳动物系统进行商业表达的原因。2
尽管上面讨论了正确折叠和PTM的问题,但许多蛋白质制造商还是使用细菌生产人类来源的蛋白质。当然,使用原核系统与哺乳动物系统相比,在蛋白质产量和易于生产方面可能有优势。
邓利维博士说:“这一切都是关于你需要什么样的蛋白质。”。“在生物化学检测中,例如western blot,你只想检测蛋白质的存在和数量,所以在非哺乳动物系统中表达的蛋白质应该是好的。然而,对于基于细胞的分析,如评估生存能力、增殖、细胞毒性或细胞死亡的分析,如果功能生物活性很重要,则必须使用与人类天然蛋白质相同的蛋白质。这意味着在哺乳动物系统中表达它”。
原核生物系统中制造的人类原蛋白较少稳定的与哺乳动物细胞系中产生的蛋白质相比,天然糖基化有助于将蛋白质正确地结合在一起。部分折叠的人源蛋白原核生产版本不稳定,容易降解,并且可能“粘稠”,即它们聚集在一起形成聚集体。这会给实验带来可变性,并降低其有效保质期。
然而,即使是早期从事发现项目的研究人员也可以从一开始就使用本土产品中获益。在开发的中途切换产品需要花费大量的时间和精力来验证结果和重复实验。与哺乳动物版本相比,原核生产的蛋白质往往价格更低,但在研究项目的整个生命周期中,考虑到潜在功能缺失的成本,以及最终必要的向天然同一产品过渡的成本,它们可能是一种比预期更昂贵的选择。此外,与细菌蛋白质相比,哺乳动物蛋白质的稳定性(以及保质期)有所提高,这使它们在任何研究阶段都是一个有吸引力的选择——一点点都会有很大帮助。
邓利维博士已经在制药和生物制药公司内部生产蛋白质超过16年。她说:“我们的科学家会要求我制造蛋白质,使其能够在活性检测中实际使用,质量足够高,折叠正确,因为他们只是找不到可以商业化购买的蛋白质。”。“我们一次又一次地看到了这一点。高质量蛋白质的商业蛋白质市场确实存在缺口,但没有大药厂资源的研究人员只能将就着买什么。这一经验促使我们Abcam公司希望提供优质的人类蛋白质,以满足生物活性检测的目的。”
所以,我们的优质生物活性级蛋白质 出生了&一系列只在哺乳动物系统中表达的小蛋白,以满足研究人员的需要,他们想要具有最佳生物活性的功能性、天然的人类蛋白质,发挥正确的生物效应。
我们的优质生物活性级蛋白质系列目前包括68种分泌的人类细胞因子我们计划在未来用更多类型的人类蛋白质来扩展目录。
签字人:苏西·查普曼博士
在这里更详细地探索生物活性蛋白。
在这里下载我们的白皮书,演示优质生物活性蛋白的批对批一致性。
1.核糖体、转录和翻译。细胞生物学基础。https://www.nature.com/scitable/ebooks/essentials-of-cell-biology-14749010/122996756/。2020年7月29日查阅。
2.Dalton,A.C.,Barton,W.A.哺乳动物细胞系分泌蛋白的过度表达。蛋白质科学。 23, 517–525 (2014). https://doi.org/10.1002/pro.2439
3.Gräslund,S.、Nordlund,P.、Weigelt,J.等人。蛋白质生产和纯化。Nat方法.5, 135–146 (2008). https://doi.org/10.1038/nmeth.f.202
4.Aebi,M.内质网中的N-连接蛋白糖基化。Biochim Biophys Acta-分子细胞研究.1833, 2430–2437 (2013). https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2013.04.001