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荧光标签,如GFP,是检测蛋白质的有用工具。
在此处下载深入的PDF指南. 从确定最佳应用程序到确定常见问题,我们的指南将帮助您充分利用您的替补时间。
自从最初绿色荧光蛋白该基因于1992年被克隆,可用的荧光标记种类激增[图1]。荧光标签的一大优点是无毒,因此可以用于活细胞。尽管是大标签,但它们对大多数蛋白质的破坏性往往最小1.
尽管GFP分子量为26.9kDa,是应用最广泛的荧光标记之一,但仍有几个重要的问题需要考虑。
图1:这些图表显示了不同荧光蛋白的激发和发射光谱。有关更多详细信息,请参阅表1下面。
表1
如果您计划使用多个荧光标签,那么选择一个具有不同发射峰值以及可用激光器瞄准的激发峰值的荧光标签非常重要。如果排放峰值重叠,将很难或可能不可能区分它们。
您通常希望在可用光谱中使用最亮的荧光标记,以获得清晰的信号并克服任何潜在的背景荧光。亮度值是蛋白质消光系数和量子产率的乘积。然而,产生的数字可能很难解释,因此,荧光标签相对于定义明确的标签的亮度,比如EGFP公司是一种常见的替代措施。
成熟度定义荧光标记正确折叠、形成生色团并开始发出荧光所需的时间。对于活细胞中的时间敏感事件,较短的成熟时间可能很重要。例如,超级文件夹GFP(sfGFP)可以在10分钟内折叠,而mOrange可能需要4个多小时。
漂白是衡量光稳定性的一个指标,即激发后多久发色团失去发光能力。如果你计划进行长时间的延时实验,考虑一个具有高光稳定性的标签。T-蓝宝石的漂白半衰期为25秒(T½;初始发射率x光子/s减少到一半的时间),但EGFP更稳定,漂白时间T½为174秒。
像大多数蛋白质一样,荧光标记受pH值、温度和氧气水平的影响。根据计划使用的环境,可能需要稍微调整条件或选择更合适的标记。
pH值可以影响激发和发射峰值,大多数荧光标记对酸敏感:有些甚至可以在pH值变化时改变荧光强度(例如pHTomato)。pKa值是pH敏感性的良好指标,因为它显示了一半发色团荧光的pH值。
此外,温度和氧气水平都会影响成熟时间:缺氧条件往往会延迟成熟时间,超出荧光标记最佳范围的温度也会延迟成熟(例如EGFP已优化为在37°C下工作)。然而,新的荧光标记如UnaG,一种从日本淡水鳗鱼中分离出的GFP(日本鰻),即使氧气含量低也会发出荧光3.
由于大多数荧光标记都来源于水母或珊瑚蛋白质,而不是类似于哺乳动物细胞和组织的东西,因此所使用的氨基酸密码子可能存在种间差异。这可能导致表达不良,从而导致低信号。
幸运的是,许多新版本的荧光标记已经过密码优化,以反映哺乳动物细胞的偏好。例如,在GFP中,Jürgen Haas及其同事通过修改GFP密码子序列将信号提高了40–120倍4.
如果使用较旧的质粒生成融合蛋白,它可能不包含修改的荧光标记序列。因此,务必检查您的序列是否已被修改以用于特定物种。
重要的是要确定标签是单体还是二聚体(单体通常由蛋白质名称前的“m”表示,例如m樱桃色)以及这是否会影响您的实验。许多早期荧光标记容易形成寡聚体,寡聚会影响融合蛋白的生物功能。例如,EGFP是一种单体,当以足够高的浓度使用时,可以形成二聚体,从而扭曲亚细胞细胞器5或破坏FRET等实验6在绝大多数情况下,建议使用真正的单体FP。
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