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D类下载您深入的PDF指南到融合标签。从确定最佳应用程序到确定常见问题,我们的指南将帮助您充分利用您的替补时间。
融合标签可用于多种应用中,例如,如果您感兴趣的蛋白质是一种新的蛋白质,则没有特定的抗体。这包括蛋白质印迹、免疫沉淀、ELISA、免疫荧光、免疫电子显微镜和表面等离子共振等技术。
用于结构研究的技术,如核磁共振波谱、X射线晶体学和低温电子显微镜,需要高质量的纯蛋白质进行分析1这意味着依赖洗涤剂或还原剂的净化方法可能不合适,因为这些可能会阻止形成优质晶体或影响蛋白质结构1.
在你感兴趣的蛋白质上贴上融合标签可以提高产量,增加溶解度,并为目标提供已知的表位,从而增强你分离目标的能力。结构研究的缺点是,融合标签会阻止有序晶体的形成,并且对于核磁共振研究来说,它可能太大。
从蛋白质中分离标签可能是一种解决方案,但这会增加实验成本。然而,超过75%的纯化结晶蛋白都附着在融合标签上。某些标记比其他标记更适合结构研究,因此仔细考虑您的实验设计非常重要。
纯化后产生功能活性蛋白对某些研究至关重要,尤其是那些研究潜在疗法的研究1功能研究的一个主要方面是保留正确的信号结构域和准确的蛋白质折叠。因此,小标签可能是首选,因为它们不太可能影响蛋白质功能。标签的位置对这些研究也很关键,因为不正确的位置会减少正确的表达。如果你的蛋白质结构已知,这可以帮助你找到最佳位置。
表位和荧光标记都是评估感兴趣蛋白质定位的重要工具。免疫荧光显微镜是最常见的可视化技术,可以通过荧光标记直接实现,也可以通过免疫检测间接实现。这还可以用于发现蛋白质的哪些区域有助于定位2.
也可以在分析前对细胞进行分级,然后分析融合蛋白,以帮助确定特定亚细胞区室的定位2.
由于荧光标记无毒,因此可以用于可视化活细胞中蛋白质的运动。
如果你想将基因导入细胞,可以使用融合标签来确保其表达。也可以使用相同或不同的标签来评估两个基因的共表达2.
重组蛋白也用于在原核系统中表达真核蛋白。这项技术通常用于获得后续研究所需的高水平蛋白质。以这种方式分离真核蛋白质的挑战之一是,其中20-40%的蛋白质无法在原核系统中以可溶性形式表达1融合标签,如GST或MBP,可以通过增加感兴趣蛋白质的溶解度来帮助克服这一障碍。
蛋白质纯化依赖于四个基本步骤:
亲和层析、免疫沉淀(IP)和蛋白质复合物免疫沉淀(co-IP)是蛋白质纯化最常用的技术2虽然这些方法都使用了上述四个步骤,但每种方法都使用不同的平稳矩阵
亲和色谱通常使用色谱柱作为固定相,并利用某些分子特性,例如氢或离子键。粗裂解物首先流过色谱柱,以便在不需要的裂解物随后被冲走之前结合感兴趣的蛋白质。您感兴趣的蛋白质可以通过添加特定的缓冲液或溶液从色谱柱中洗脱出来。
另一方面,IP的固定相是针对感兴趣蛋白质的抗体。细胞裂解物与固定相孵育,使抗体与溶液中的蛋白质结合。然后,可以使用蛋白A/G偶联琼脂糖珠从样品中提取抗体/抗原复合物以进行后续分析,例如,使用SDS-PAGE分离以进行western blot分析。
Co-IP也使用抗体来结合已知的靶点,但其目的是将感兴趣的蛋白质连同它所结合的任何其他蛋白质一起拉下来。通过这种方式,可以找到新的结合伙伴或蛋白质网络1为了全面了解与您的主要已知蛋白质相关的蛋白质网络,后续实验通常包括重复co-IP,将额外下拉列表中发现的蛋白质作为目标。
虽然需要一些时间才能找到你感兴趣的蛋白质的最佳标签,但我们知道有一个起点是很好的。因此,我们概述了一些广泛使用的标签,并对其分子量进行了比较[图1]。
蛋白质纯化以下为:伊斯-标签,生物素,c-myc
蛋白质表达:DDDK、美国海关与边境保护局
蛋白质定位和检测以下为:GFP公司,m樱桃,哈
免疫沉淀:c-myc、DDDK
蛋白质定位: GFP公司,m樱桃
功能分析:DDDK公司
增加蛋白质溶解度:消费税
图1:广泛使用的融合标签的分子量比较