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维西科尔HISTO公司是一种组织清除技术,由维西科尔,Inc.通过折射率匹配过程使组织透明。使用维西科尔 HISTO公司该技术将组织固定、加工、标记,然后脱水,然后用维西科尔 HISTO公司。这种方法是可逆的,因为可以使用维西科尔 HISTO公司其次是反转和传统二维嵌入和基于幻灯片的组织学,便于临床应用验证。
组织清除试剂盒和试剂
Abcam提供组织清除试剂盒和试剂,由Visikol®HISTO™组织清洁技术。
我赚取更多关于组织清除试剂盒和经组织清除验证的抗体、以及组织清除成功的建议组织清洁指南.
背景
使组织透明是一个相对容易的过程,可以通过去除脂质(如CLARITY1)、蛋白质水合作用(例如鳞片2)或折射率匹配(例如iDISCO三Visikol HISTO公司4、BABB5). 组织清除的主要挑战是将组织清除与荧光标记有效配对,并使用共焦的、薄片或多光子显微镜。这一挑战的原因是,每个组织和标签在组织清除方面的行为不同,并且每个成像方式都有其优点和缺点。
通过与数百个研究小组的广泛测试,Visikol开发了一套完整的指南,允许研究人员为其特定的动物模型、组织、标签、固定技术和成像设备建立定制协议,从而克服了这些问题。
通用协议
Visikol HISTO协议将根据所使用的组织类型和所需的标签发生显著变化。一般流程概述如下:
设备
试剂
所使用的试剂将因正在处理的组织类型而异。随Visikol方法试剂提供的协议具体描述了每次应用所需的试剂以及所需试剂的量。
次级抗体
组织
利用Visikol HISTO技术,可以处理任何动物的组织和从显微组织到整个大鼠大脑的组织,这些组织可以是石蜡、包埋、保存在福尔马林中或新鲜的。然而,对抗背景荧光的方法和用于组织的特定处理步骤将因其制备方法而异。
成像
由于Visikol HISTO方法可以应用于多种组织类型和大小,因此用于特定应用的成像方式会有所不同。
用于对清除的组织进行成像的成像设备类型主要取决于所需的分辨率和成像的组织体积。通常,大多数共焦显微镜和高含量共焦显微镜可用于对深度小于500µm的组织进行成像。然而,由于折射率不匹配导致的图像畸变,深度超过500µm的空气物镜和倒置共焦显微镜将受到限制。对于组织的深/高分辨率成像,建议使用倾斜物镜。由于Visikol HISTO是一种基于溶剂的技术,如果使用甘油或水浸物镜,则应使用外部带有2,2'-硫代二乙醇的双室试管进行此类成像(ClearWells™),因为Visikol-HISTO可能会损坏这些物镜。对于大组织体积(如整个小鼠大脑)的低分辨率成像,建议在La Vision Biotec Ultrammicroscope II或Zeiss Z.1中使用薄片显微镜。虽然Ultrammicroscope II与溶剂兼容,但Z.1需要特殊的组织准备才能与Visikol HISTO等溶剂兼容。
材料(96孔板中的每个孔)
渗透缓冲器
(PBS/0.2%Triton X-100/0.3M甘氨酸/20%二甲基亚砜)
10X洗涤缓冲液
(10X PBS w/2%吐温-20和100µg/ml肝素)
阻塞缓冲区
(PBS/0.2%Triton X-100/6%驴血清/10%二甲基亚砜)
组织加工
1.将组织固定在选定的固定剂中。固定24小时后,取出并用0.05%叠氮化钠转移到PBS中,以便不定期储存。
2.在进一步操作之前,在至少200µl PBs溶液中清洗组织至少1小时,以去除固定剂的痕迹。
3.如果组织已被冷冻保存,则用200µl PBS再清洗3-5次至少1小时,以确保完全去除安装介质。
抗原检索
1.在室温下,在200µl PBS中洗涤组织15分钟,最后在200µl 100%甲醇中洗涤15分钟。在进行下一步之前,可以将样品无限期地储存在甲醇中(最好在4°C下)。
2.在室温下,将样品在200µl 20%二甲基亚砜/甲醇中清洗2分钟两次,然后再将样品在20µl 80%甲醇(H2O) 200µl 50%甲醇(PBS中)2分钟,200µl PBS 2分钟,最后在200µl/1%Triton™X-100中2分钟,然后再进行进一步染色。
3.在室温下将样品放入200µl渗透缓冲液中培养15分钟,轻轻摇晃。
4.将样品置于37°C下200µl封闭缓冲液中,轻轻摇晃15分钟。
5.将样品转移到200µl抗体缓冲液中制备的一级抗体稀释液中,并在37°C下轻轻摇晃30分钟。
根据特定抗原,通常需要1:50至1:500的抗体稀释度。为了防止聚集,建议在使用之前离心或通过0.45µm注射器过滤器过滤溶液。
6.使用前,务必将10X洗涤缓冲液稀释至1X工作浓度。
7. 用200µl清洗样品 1倍 洗涤缓冲液(5次,每次5分钟,37°C,轻轻摇晃)。
8.根据优化实验的结果,将所需的核标记以1:100-1:5000的稀释度添加到二级抗体缓冲液中。
9.在37°C下,在200µl抗体缓冲液中制备的二级抗体缓冲液(1:50至1:500,取决于一级抗体的稀释度)中孵育,轻轻摇动。将样品培养30分钟。
10.在37°C下,在200µl 1X洗涤缓冲液中洗涤95次,每次5分钟,轻轻摇晃)。在进行进一步的步骤之前,样品可以无限期地保存在该溶液中。
组织清洁
1.在室温下用200µl 100%甲醇处理组织2分钟,轻轻摇晃。
2.从甲醇中取出,确保用Kimwipe™或纸巾吸收多余的甲醇。
3.向类有机物中添加200µl Visikol Histo-M,然后继续直接成像。
成像制导
清理后,不要将样本转移到其他介质中。为了获得最佳结果,应直接在Visikol HISTO试剂中进行成像。Visikol HISTO溶液含有防褪色剂,使用Visikol-HISTO清除的标本无需安装在额外的防褪色介质中。其他溶液(尤其是水介质)会使组织变得浑浊或完全逆转清除,干扰3D体积成像。清除的组织成功成像后,请参阅下文了解有关反转清除以执行下游分析的更多信息。
NCI 2170肺癌类有机物,Nuclei标记为SYTOX公司(蓝色),增殖细胞标记为抗Ki67抗体,ab15580型(红色)。
1Tomer,R.、Ye,L.、Hsueh,B.和Deisseroth,K.(2014)。先进的清晰度,可对完整组织进行快速高分辨率成像。自然协议,9(7),1682。
2Hama,H.、Kurokawa,H.和Kawano,H.,Ando,R.、Shimogori,T.、Noda,H.…&Miyawaki,A.(2011年)。鳞片:一种用于荧光成像和透明小鼠大脑重建的化学方法。自然神经科学,14(11),1481。
三Renier,N.、Wu,Z.、Simon,D.J.、Yang,J.、Ariel,P.和Tessier-Lavigne,M.(2014)。iDISCO:一种简单、快速的免疫标记大组织样本的方法,用于体积成像。细胞,159(4),896-910。
4Merz,G.、Schwenk,V.、Shah,R.G.、Necaise,P.和Salafia,C.M.(2017年)。免疫标记人胎盘绒毛的澄清和三维可视化。胎盘,53,36-39。
5Van Noorden,C.J.(2017)。富含细胞外基质的人体组织的三维组织化学和成像。FASEB期刊,31(1增补),980-5。