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为了获得准确和精确的结果,您需要持续特异性和选择性地结合到预期目标的抗体。 抗体验证必须特定于应用程序才能有效抗体在哪些应用程序中得到验证的信息可以在任何抗体数据表的“测试应用程序”部分中找到。
在这里,您可以找到有关我们在特定于应用程序的验证过程中执行的操作的更多信息。
查找您的应用程序:
开发夹心ELISA需要仔细选择一对匹配的抗体(检测器和捕获抗体),这两种抗体都能与目标蛋白特异结合。这些抗体成对筛选性能对这些抗体的验证至关重要。只有对目标物显示出高度特异性、选择性和一致线性稀释的抗体组合才能用于进一步开发。
我们使用刺突回收实验来验证抗体选择性,从而验证每对抗体在血浆、血清或组织裂解物中的性能。该方法涉及将纯化的重组目标蛋白“加标”到生物基质中,应在所提供稀释剂中试剂盒预期蛋白标准信号的-/+20%变化(80-120%)内对其进行回收和检测。在生物基质和样本基质的标准稀释剂中观察到的峰值回收率应几乎相同,以确保我们的ELISA试剂盒有效。还使用夹心ELISA对样品稀释液进行了线性研究,以确保我们的抗体对不仅识别纯化的重组蛋白,还识别天然目标蛋白。为此,我们在一系列稀释液中平行测量标准蛋白质和蛋白质的天然信号。如果标准蛋白质和天然信号均按比例稀释,则在所有测试剂量下,经稀释校正后,插值样本值将具有相同的值。通过将稀释因子乘以计算的浓度来确定目标蛋白的浓度(图1)。
图1。人PSA SimpleStep®ELISA试剂盒在细胞培养物、血清、血浆和尿液中定量人前列腺特异性抗原(PSA)的稀释线性。对稀释样品进行两次测量,并将计算浓度乘以稀释系数,以确定最终浓度。
为了进一步验证ELISA中使用的抗体特异性,我们测试抗体与相关蛋白质或家族成员的结合程度。这使我们能够测量任何交叉反应性和干扰。例如,为了确认用于ELISA的CXCL2抗体的特异性,我们使用CXCL3和CXCL1进行测试,它们分别与CXCL2具有82%和63%的氨基酸同源性。在这种情况下,相关家族成员蛋白质显示出类似于背景吸光度值。为了确定物种反应性,我们还将检查从不同物种(即小鼠、兔子、山羊、大鼠等)获得的相同蛋白质,以确认抗体对人类蛋白质具有特异性。我们可接受的结果显示交叉反应性小于5%。
重组技术用于生产抗体对和ELISA试剂盒的抗体。这意味着一旦开发出来,我们的抗体对和ELISA显示出较高的批对一致性。
使用我们已经鉴定的细胞或组织的裂解物在western blot中验证抗体表达感兴趣的蛋白质.一旦我们确定了要使用的正确裂解物,就要进行western blot,并检查条带大小是否符合预期的分子量。 在同一个western blot实验中,我们将始终运行多个对照,包括阳性裂解物和阴性裂解物(如果可能,见图2)。
如果可能,我们还包括敲除(KO)细胞系作为真正的阴性对照品。我们一直在增加KO-有效抗体我们提供。我此外,我们在经营新股的同时经营旧股。如果我们知道旧股票运作良好,这也是一种适当的积极控制。
如果western blot结果给出一个清晰的干净带,并且我们对控制通道的结果感到满意,那么这些抗体将被传递并添加到目录中。
图2。所有泳道:抗p53抗体[DO-1]–ChIP等级(ab1101)。通道1:野生型HAP1细胞裂解物(20µg)。通道2:p53敲除HAP1细胞裂解物(20µg)。通道3:A431细胞裂解液(20µg)。通道4:Saos-2细胞裂解物(20µg)。使用山羊抗鼠IgG H&L(IRDye®800CW)预吸收抗体ab216772检测抗体结合。图中显示合并信号(红色和绿色)。绿色:在53 kDa下观察到ab1101。红色:GAPDH负载控制,ab181602,在37 kDa下观察到,用作次级山羊抗兔IgG H&L(IRDye®680RD)ab216777
IHC和ICC根据细胞和亚细胞定位来确定抗体是否识别正确的蛋白质。通过观察在同一组织中表达或不表达目标蛋白的细胞,可以确认抗体的特异性。最初,我们的科学家将审查现有文献,以确定用于验证的最佳细胞系和组织。然后,我们通过IHC/ICC检查蛋白质表达,看看它是否具有预期的细胞定位(图3)。如果信号的定位如预期的那样,这种抗体将通过,并被认为适合在IHC/ICC中使用。
我们使用了多种方法,包括在抗体形成过程中染色多正常人组织微阵列(TMA)、多肿瘤人TMA和大鼠或小鼠TMA。这些高通量阵列使我们能够同时检查许多组织,在所有组织暴露于完全相同的条件下提供一致性。
我们目前正在努力使用KO细胞系进行ICC验证。
图3。人扁桃体福尔马林固定石蜡包埋组织切片中ab205921染色PD-L1的IHC图像。然后用苏木精对切片进行复染、涂蓝、脱水、清洗并用DPX固定。
肽阵列是一种高通量的抗体验证方法,允许我们一次测试抗体对500多肽的特异性(图4)。 当我们测试我们的组蛋白修饰抗体因为它允许我们检查不同修改之间的交叉反应性。
我们使用液体处理器对肽进行六次连续稀释,然后将其打印到硝酸纤维素载玻片上,一式三份,并用于同时评估抗体对所有这些肽的结合特异性。
我们运行的每一张硝化纤维载玻片都包含几个基本的阳性和阴性对照,以评估抗体特异性。我们将旧的库存批次与新的抗体测试批次进行并行比较。我们还对自己的抗体和竞争对手的外部抗体批次进行肽阵列验证,以比较抗体的性能。
图4.ab176916在肽阵列中测试501种不同的修饰和未修饰组蛋白肽;每个肽以六种浓度打印在阵列上(每种浓度一式三份)。圆圈区域表示抗体和肽之间的亲和力:所有含抗原肽显示为红色圆圈,所有其他肽显示为蓝色圆圈。当根据相应的肽浓度绘制抗体结合值时,亲和力计算为曲线下的面积。每个圆圈区域归一化为亲和力最强的肽。
在我们开始使用肽阵列之前,我们经常使用斑点杂交来验证组蛋白修饰抗体。我们网站上的许多组蛋白修饰抗体仍将包含斑点印迹验证信息,并声明它们适合用于斑点印迹。
该技术使用与肽阵列类似的原理,将若干肽的系列稀释液绘制到硝酸纤维素上,我们检查我们感兴趣的抗体对这些对照肽的特异性(图5)。
图5。用ab176916标记的组蛋白H3(三甲基K9)肽(Lane 1)、组蛋白H3K9未修饰肽(Lane2)、组分H3(巴豆酰K4)肽(Lane 3)和组蛋白H4K4未修饰肽类(Lane4)的斑点杂交分析,然后是山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab97051)。
我们现在已经避免在最近的抗体批次中使用斑点杂交,因为我们的内部肽阵列效率更高,并且允许我们一次验证针对数百个肽的抗体。我们仍会偶尔使用斑点杂交,但仅用于确认我们获得的肽阵列数据。
在批量测试我们的抗体时,我们不将IP作为标准;然而,如果有要求,我们将对单个抗体进行此操作。
当我们验证IP抗体时,我们使用磁珠执行标准IP协议,因为我们发现这些磁珠可以在更短的时间内获得更好的结果。一旦我们分离出感兴趣的蛋白质,我们将上清液与IP的流出液一起进行蛋白质印迹。我们还对我们测试的每种裂解液进行了无抗体和只含珠的对照。我们用的是同一个西方污点。当我们这样做的时候,我们正在寻找一个在我们的IP样本中具有预期蛋白质大小的干净带。我们也在检查印迹的其他泳道,以检查在我们的阴性对照中也会出现的非特异性结合(图6)。
图6。用ab228415从0.35 mg NCI-H1975(人非小细胞肺癌细胞系)全细胞裂解液中免疫沉淀PD-L1。使用ab228415对免疫沉淀物进行蛋白质印迹。IP检测试剂(HRP)的VeriBlot(ab131366)用于1/5000稀释度的检测。通道1:NCI-H1975全细胞裂解液10µg(输入)。通道2:NCI-H1975全细胞裂解液中的ab228415 IP(+)。通道3:兔单克隆IgG(ab172730),而不是NCI-H1975全细胞裂解液(-)中的ab228415。
对我们的组蛋白修饰抗体进行ChIP测试。在通过肽阵列测试抗体特异性后,使用ChIP检查与DNA复合的蛋白靶点是否可以使用我们的抗体被拉下。
对于ChIP实验,我们使用从甲醛交联HeLa细胞或小鼠NIH/3T3细胞中提取的染色质。我们使用我们的标准ChIP协议执行ChIP,并使用一组已知每个组蛋白修饰的阳性和阴性对照位点的引物通过qPCR检查下拉的性能。这为我们提供了活性和非活性基因组控制区域中抗体结合的概况(图7)。
图7。根据Abcam X-ChIP协议,从HeLa(宫颈腺癌人上皮细胞系)细胞制备染色质。使用25µg染色质、2µg ab45173(蓝色)和20µL A/g琼脂糖珠浆料(10µL琼脂糖A珠+10µL琼脂糖g珠)进行ChIP。将兔正常IgG添加到珠子对照组(黄色)。免疫沉淀DNA通过实时PCR(TaqMan方法)定量。
为了传递抗体,我们检查从ChIP-qPCR获得的图谱是否符合我们的预期,即我们的乙酰化组蛋白修饰抗体与基因组上的活性区域结合(图7)。我们还测试了新库存的下拉强度,并将其与以前的批次进行比较,以确保各批次之间的下拉能力一致。
我们在每个ChIP验证实验中使用了几个标准对照,包括IgG和纯珠阴性对照。除了我们用来控制q-PCR的阳性和阴性基因座外,我们还在每个验证实验中使用无模板阴性对照。
我们目前正在进一步开发我们的ChIP方法和ChIP验证协议,并正在努力验证我们目录中的更多抗体。
在验证流式细胞术抗体时,我们仔细优化染色方案的每一步,包括固定、渗透和清洗。为了做到这一点,我们的科学家查阅了现有的文献,以了解哪些细胞类型和条件最适合验证特定抗体。
我们包括相关对照,常规运行的未染色、阳性、阴性、同种型、活力、Fc阻断、荧光减一(FMO)和单染色对照。对于FMO对照,我们用荧光共轭物对所有样品进行染色,除了正在测试的样品。这显示了其他荧光共轭物在未标记通道信号中的贡献。这种控制对于确定抗体的非特异性结合非常重要。
同位素对照是一种良好的阴性对照,它允许我们从特定抗体结合所发出的信号中确定背景信号。这些对照组使用与您正在验证的主要抗体同型相匹配的主要抗体,但这些抗体对靶点没有特异性。无论何时,我们都会在流式细胞术验证中使用许多KO细胞系。如果抗体提供阳性流式细胞术信号并通过我们所有的对照实验,我们将提供这种抗体供购买,并声明它适合用于流式细胞术。
我们正在使用通过CRISPR/Cas9从细胞模型生成的人类KO细胞系,通过正在进行的KO验证程序解决抗体特异性问题。KO模型为抗体验证提供了极好的标准,因为它们代表了真正的阴性对照。遗传KO模型之所以如此强大,是因为它们允许我们通过观察功能丧失表型来了解基因的功能。我们有数百种KO验证的抗体,也从我们的目录中删除了任何非特定抗体。
图8。通过免疫组织化学-敲除(KO)试验检测PD-L1 RabMAb(ab205921)的特异性。在人肺腺癌肿瘤细胞系L2987中观察到抗PD-L1的强IHC检测。使用靶向人类PD-L1外显子4、转录变体1(NM_014143.3)和克隆L2-14的深度测序证实的完整KO的TALEN构建物在L2987细胞中编辑PD-L1基因。L2987 L2-14 KO细胞系中消除了IHC检测。
图9。通过流式细胞术-敲除(KO)试验检测PD-L1 RabMAb(ab205921)的特异性。用抗PD-L1 TALEN构建靶向人类PD-L1外显子4、转录变体1(NM_014143.3)和完整KO的强检测结构,并通过克隆L2-14的深度测序证实。L2987 L2-14 KO细胞系的细胞表面染色几乎消失。
为了确保在同一抗体的批次中获得相同、准确的结果,我们进行一致性测试以评估批次间的差异。
对于重组抗体,批次之间的一致性非常高,这意味着不太可能需要在批次之间执行额外的优化程序(例如滴定实验)。其他非重组杂交瘤生产的单克隆和多克隆抗体的变异和漂移程度本来就较高,但情况可能并非如此。
当可用且适合于分析开发时,重组单克隆抗体受到青睐,并提供最佳的批间一致性(图8)。
图10。通过IHC对PD-L1 RabMAb(ab205921)进行批量测试–对CHO PD-L1表达细胞进行分析。A: 兔IgG,5µg/mL,无染色。B: 抗PD-L1,2µg/mL(第1批)。C: 抗PD-L1,2µg/mL(第3批)。D: 抗PD-L1,2µg/mL(第4批)。E: 抗PD-L1,2µg/mL(第5批)。F: 抗PD-L1,2µg/mL(第6批)。G: 抗PD-L1,2µG/mL(第7批)。所有批次(1,3,4,5,6,7)的结果一致。
生物物理测试能够在分子水平上确认抗体的身份,在大量产品组合中提供稳健、可重复和高质量的结果,以获得最佳的批对批一致性。
我们使用多种方法作为稳健质量控制流程的一部分,包括: