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融合标签是融合到您感兴趣的蛋白质上的已知蛋白质或肽。
从确定最佳应用程序到确定常见问题,我们的指南将帮助您充分利用您的替补时间。
指南中的章节:
融合标签简介
有很多理由强调一种感兴趣的蛋白质:也许你想观察它的细胞定位或纯化它以结晶。虽然有许多蛋白质的商用抗体,但有时很难针对某一靶点产生特异性抗体。为了克服这些问题,科学家们开发了一个广泛的融合标签分子工具箱。
融合标签是一种已知的蛋白质或肽,它融合到你感兴趣的蛋白质上。由于这些标签具有很好的特征,因此有各种各样的顶级抗体可用,从而可以方便地检测各种应用中的特定蛋白质。将已知序列附加到蛋白质上最常见的方法是使用重组DNA,将感兴趣的蛋白质的DNA并入包含融合标签序列的质粒中。当这个质粒被表达时,融合标签将附着在蛋白质上[图1]。
除了要使用哪个标记外,还应仔细考虑链接器序列。链接器序列将您的蛋白质连接到标签,对于确保正确的蛋白质折叠和功能非常重要。连接序列可以是刚性的、柔性的或可分割的,并且像融合标签一样,每个序列都有不同的属性1.
图1:首先,将感兴趣蛋白的DNA和融合标签插入质粒。然后将其转录并翻译,以创建与融合标签相连的感兴趣的蛋白质。
优势
缺点
融合标签主要有三类,用于不同的应用:表位标签、亲和标签和荧光标签。
表位标记通常是短肽序列,可用于免疫应用,如western-blot和免疫共沉淀。
认同标签通常较长,用于蛋白质纯化或增加蛋白质溶解度。
荧光标签可用于活细胞和死细胞,并主要用于成像研究,如细胞定位和共表达实验。
你是否选择将标签融合到你感兴趣的蛋白质的C或N末端,很大程度上取决于蛋白质本身:它是如何折叠的,你选择的末端是否有功能要求。例如,如果C末端折叠在蛋白质内部,你就不太可能收到任何融合蛋白信号;或者,如果你的蛋白质在你的标签融合的末端被翻译后裂解,那么你的标签就会从你感兴趣的蛋白质中移除。
如果您有资源或者您的实验是新颖的,那么最好克隆C和N末端标记的构造,以确定最佳选项。一个研究小组发现,与N末端标记的融合蛋白相比,更多的C末端融合蛋白定位于预定的亚细胞隔室 2然而,重要的是要强调,虽然C末端标记的蛋白质倾向于按预期定位和行为,但这并不总是可以预测的。免疫荧光可用于检查融合蛋白是否正确定位;免疫印迹将有助于确认融合蛋白的大小是否正确并以预期水平表达,联合免疫沉淀有助于评估融合蛋白如何与已知底物相互作用三.
接下来的步骤
如果您想了解更多信息,请参阅我们的页面:
如果您正在考虑使用多个应用程序或需要删除标签,请阅读更多有关串联亲和纯化和标签切割.
如果您想了解更多有关如何检测标签的信息,请访问我们的检测和应用第页。
有没有我应该使用的特定标签?
不幸的是,对于哪个标签或融合位置最适合你的实验,还没有明确的答案。我们建议使用指南中的信息,根据您的目标和应用程序选择起点4.
问问自己关键问题:
我需要查看活细胞中的蛋白质。我应该使用哪个标签?
如果你想查看活细胞中的蛋白质,请使用荧光标签。有多种荧光标记可供选择,如果需要,可以检测多种蛋白质。查看我们的荧光标签页面以了解更多信息。
我想看看我的蛋白质定位在哪里。我应该使用哪个标签?
许多标签都有高质量的初级抗体,但通常使用表位标签。阅读我们的表位标签页面以了解更多信息。
什么标签最适合净化?
虽然许多标签可用于纯化,但亲和标签是最常用的。阅读我们的亲和标签页面,了解哪一个最适合您的应用程序。
如果我的标签不起作用,我该怎么办?
如果一开始没有获得最佳结果,请尝试改变标记的位置、更改或添加蛋白酶站点、修改链接器序列或附加多个标记以利用每个标记的属性。此外,新型标签也在不断开发。这些新标签有时是为了特定目的而建立的,或者它们旨在建立在现有标签的特定属性之上。
我在哪里可以找到常见标签的分子量?
您可以使用我们的图表比较常见亲和力、表位和荧光标记的分子量。
密切关系标签
hhhh
表位标签