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2021年5月27日出版
确认抗体特异性是检测开发的重要组成部分。准确检测感兴趣分析物的能力,即使是在低表达水平下,对于在药物发现管道的每个阶段实现可重复的结果至关重要。因此,分析验证是一个连续的过程,从最初的分析开发到将分析应用于不同的样品或流程。
在我们的点播网络研讨会中,进一步了解我们如何克服与KO细胞系合作的常见挑战。
专家们强调了关注点这种抗体通常没有足够的特异性来满足其预期用途,并且可以与非靶蛋白1发生交叉反应。抗体特异性可以通过广泛验证来确认,从而提高研究结果的质量和再现性。对检测开发中使用的抗体进行彻底验证,可确保高检测特异性,加快为需要的患者提供有效治疗的过程。
然而直到最近,还没有公认的科学框架来确保抗体特异性。2016年,全球科学家成立了抗体验证国际工作组,概述了五项关键技术或支柱,以成功验证研究和治疗性抗体2.
在这里,我们讨论了五大支柱,每种方法的优缺点,以及我们的解决方案如何提高检测特异性以实现您所需要的高性能。
遗传策略| 正交策略| 独立抗体策略| 标记蛋白的表达| 免疫沉淀质谱法
抗体特异性可以通过比较表达靶蛋白的细胞与对照细胞中的结合信号与被CRISPR或RNA干扰(RNAi)敲除的靶基因来评估。如果靶点不存在,高度特异性抗体应无结合活性。
虽然RNAi可以用于抑制蛋白质表达,但RNAi的短暂性及其无法完全敲除关键基因意味着这种方法可能不可靠。
敲除(KO)细胞系提供获得高抗体特异性的最直接途径,通常被认为是金标准技术。建立可靠的KO细胞系可能是一个费力的过程,但现成KO细胞株的可用性加快了分析开发并提高了该策略的可行性。
正交策略包括使用抗体依赖性分析(如转录组学或靶向蛋白质组学)评估靶蛋白丰度,并将结果与使用抗体在一系列相关样本中获得的结果进行比较。
虽然由于高通量分析技术,这种方法可以很快实现,但它依赖于额外的工具和技术。此外,这些次要方法的结果可能很难解释。例如,将转录组数据与抗体特异性相关联可能特别具有挑战性,因为mRNA和蛋白质丰度之间的关系是非线性的,并且通常具有高度的可变性。
评估两种独立抗体的抗体结合是提高检测特异性的另一种策略。该方法包括将所需抗体与在同一靶蛋白上具有非重叠表位的第二抗体进行比较。
虽然这项技术提供了简单的验证和直接的结果,但它依赖于一种合适的独立、经验证的抗体进行比较。重组抗体对这种策略特别有用,因为它们提供了高批对批的一致性、可靠的持续供应和高特异性。
用融合标签通过比较来自抗体的信号与tag特异性信号,可以确定抗体特异性。示例包括使用关联标记例如用于生化分析的c-Myc或His或荧光标签比如用于显微镜或流式细胞术的绿色荧光蛋白(GFP)。
与遗传策略类似,这种方法需要额外的时间和技能才能成功表达标记蛋白。获取或创建包含感兴趣的蛋白质和标签的功能性质粒也具有挑战性。
标签本身也可以改变目标蛋白的特性,如溶解度或定位,从而导致虚假结果,而蛋白质的过度表达会因非特异性结合而产生假阳性信号。
免疫沉淀质谱法(IP-MS)涉及使用细胞裂解液的免疫沉淀法和质谱法分离和分析抗体结合的所有蛋白质,揭示真正的靶蛋白和任何非靶结合。
虽然这是证明抗体特异性的最佳技术之一,并且适用于高通量分析,但它有几个局限性。
首先,并不是所有的抗体和靶点都适合免疫沉淀,而且该方案的优化可能具有挑战性。根据起始裂解物中目标蛋白亚型或相关家族成员的相对丰度和结合强度,结果也可能会出现偏差。
最后,很难区分非靶向结合信号和与靶向形成复合物的蛋白质,这使得数据难以解释。
在整个发现流程中实施化验验证可能是一个艰巨而昂贵的过程,但它对于确保结果的可靠性和可重复性至关重要。 无论你是想购买现成的抗体还是验证自己的抗体,我们都在通过简化抗体验证来应对再现性危机并推动科学向前发展。
为了确保无与伦比的特异性并快速推进您的发现工作流,我们验证我们的抗体使用敲除细胞系的金标准方法。如果您选择使用独立抗体方法,我们的范围广泛,超过24000个重组抗体很可能与您的目标相匹配。 此外,我们拥有2000多个产品组合现成的线条确保您可以快速找到特定的基因验证策略淘汰。
确定抗体特异性对于推动长期成功至关重要,选择高质量、经过验证的试剂将加快发现新的、令人兴奋的治疗方法的步伐。