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一切必要在实验装置中成功验证抗体特异性需要考虑的因素。
下载我们的抗体基础综合指南。
2022年5月17日更新
目录
抗体验证围绕着证明三个关键方面:
在这里,我们将重点关注如何在实验装置中验证抗体特异性,以确保结果的准确性和一致性。尽管一个好的制造商通常 测试抗体 在一些应用和物种中,不可能解释研究人员使用抗体的众多方案和试剂。因此,您的抗体验证步骤非常重要,因为它们针对您的设置。
验证抗体特异性时需要考虑的关键点
1.阳性和阴性对照品的选择和准备
识别和使用适当的阳性和阴性对照物对成功的抗体验证至关重要。
确定表达或不表达目标蛋白的细胞或组织类型通常具有挑战性。您可以在同行评审论文和在线蛋白质数据库中找到有关不同组织或细胞系中目标蛋白表达的信息,包括:
然而,使用在线数据库定义蛋白质表达谱存在一些限制:
此外,抗体可能识别或不识别天然或变性状态的蛋白质。因此,必须相应地制备试样。例如,只识别天然形式蛋白质的抗体不应用于使用变性条件(如western blot)的样品。
请参阅我们的样品制备指南西方印迹或酶联免疫吸附试验.
2.协议
确保使用优化的方案,使抗体有最好的机会通过验证过程。例如,孵育时间可能会有很大变化,从至少一小时到4°C下过夜,因此您需要确定每个抗体的最佳孵育期。如果潜伏期太短,您可能会遇到敏感性问题,而延长潜伏期可能会导致背景染色。您还需要优化其他因素,例如工作稀释、封闭条件以及天然与变性条件的使用。
查看我们的抗体协议和故障排除提示指南。
3.缓冲器的选择
大多数抗体检测将使用两种缓冲液类型:PBS或TBS。您需要考虑可能影响缓冲液性能的参数,如pH值,为实验确定最佳缓冲液。
请参阅我们的缓冲区建议最佳蛋白质印迹结果和抗体储存。
内源性表达或缺乏目标蛋白的细胞系或组织可分别作为阳性或阴性对照。您可以使用几个具有不同蛋白质表达水平的不同细胞系来提供一系列控制。或者,可以使用多种方法设计适当的阳性和阴性对照,包括敲除模型、siRNA敲除和细胞治疗(表1)。
表1。设计适当的积极和消极控制的模型。
验证
好处
限制
敲除(KO)型号
细胞系、组织或裂解物,其中用遗传工具(如CRISPR)消除感兴趣的蛋白质编码基因
KO模型作为真正的阴性对照
保证目标基因不表达
你可以使用KO细胞系或所有分析中的组织:western blot、IHC、ICC、流式细胞术
您可以通过使用商用产品节省时间KO细胞系或细胞裂解物为您感兴趣的基因(取决于可用性),而不是生成您自己的KO模型
针对“基本”基因的KO细胞系并不总是可行的
KO样本中缺乏信号表明抗体检测到野生型样本中感兴趣的蛋白质。它不能保证Ab在不同的样品背景中不会非特异性地结合到不相关的蛋白质上。
siRNA敲除
使用转录后基因调控工具,如小分子干扰RNA(siRNA).
通过下调目标蛋白来确认特异性
敲除细胞系可用于所有分析:western blot、ICC、流式细胞术
击倒是暂时的
敲除很少100%有效,因此需要良好的控制,例如实时PCR和针对控制基因的成熟siRNA。
当siRNA与类似转录物结合并沉默“非靶点”时,可能会观察到非特异性表达减少
细胞治疗
蛋白质表达水平在细胞内被控制
可以增加或减少特定蛋白质的表达水平,或影响翻译后修饰,例如磷酸化(例如通过饥饿)
这些可以作为积极或消极的控制
需要额外的控制以确保细胞处理有效
设计实验可能很有挑战性
您可以使用几种不同的方法来验证抗体。下面我们概述一些流行的应用程序,它们的优点和局限性。
质谱/免疫沉淀质谱(IP-MS)
首先是蛋白质复合物免疫沉淀的从细胞裂解物中提取,然后用质谱法进行分析
适用于高吞吐量格式
使用归一化技术估计与感兴趣抗体结合的目标蛋白丰度的潜力
能识别抗体结合的所有蛋白质亚型
能够识别翻译后修饰、相互作用的合作伙伴和复合体,
根据消化的蛋白质片段确认特异性
过多清洗IP可能会清除弱或中等粘结剂
并非所有抗体都适用于IP
区分复合物中的伴侣蛋白和非靶向结合蛋白可能是一项挑战
解释数据可能很棘手,因为最高的富集分数并不总是意味着这是抗体优先结合的目标ff-目标绑定可能很难演示。需要同种对照抗体,但IP之间可能仍存在差异。
蛋白质印迹
通过初始尺寸分离检测样品中的蛋白质,然后将其印在膜上,以通过抗体进行可视化
用于根据分子量确定针对目标蛋白的抗体特异性
非常适合检测还原/变性蛋白质
定性分析
耗时分析
与其他一些应用程序相比,不容易实现自动化
免疫细胞化学(ICC)
通过特定抗体和报告分子检测细胞中的蛋白质
根据细胞定位验证抗体是否识别正确的蛋白质
特异性在表达或不表达目标蛋白的细胞中得到证实
无法确定抗体是否能识别具有相同细胞定位的非特定蛋白质
免疫组织化学(IHC)
通过特定抗体和报告分子检测组织中的蛋白质
验证抗体是否根据组织内的定位识别正确的蛋白质
特异性在表达或不表达目标蛋白的组织样品中得到证实
无法确定抗体是否识别具有相同组织定位的其他非特定蛋白质
蛋白质/肽阵列
抗体结合事件是通过先用肽/蛋白质检测阵列,然后添加抗体(类似于ELISA)来检测的
允许筛选与多种不同蛋白质/肽结合的抗体
高通量筛选工艺
仅蛋白质阵列:无法筛选翻译后修饰的蛋白质 如果阵列由大肠杆菌(细菌)合成的蛋白质组成
由肽和变性蛋白质制成的阵列仅呈现线性表位供查询
注意,以下两种方法不能被视为抗体特异性的详尽测试;因此,我们不建议单独使用它们: