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IHC中的显色检测方法依赖于将可溶性底物转化为不溶性显色产物的酶。
这些酶通常与二级抗体结合,二级抗体与相关蛋白的一级抗体结合。也可以使用与酶直接结合的初级抗体。最常用的酶是辣根过氧化物酶(HRP),它将3,3'-二氨基联苯胺(DAB)转化为棕色产物,以及碱性磷酸酶(AP),它把3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)转化为红色产物。
由于该方法涉及更高的信号放大,显色检测通常比荧光检测更灵敏。此外,与荧光灯不同,由DAB等基底产生的有色沉淀物具有光稳定性,能够将载玻片保存多年。荧光检测需要专用光源和滤光片,而显色检测只需要标准显微镜。然而,实验过程较长,因为它比荧光方法包含更多的孵育和阻断步骤。
目前广泛使用四种主要的间接显色检测方法。基于生物素的方法使用亲和素-生物素复合物(ABC)或标记的链霉亲和素生物素结合物(LSAB)复合物。基于非生物素的方法采用聚合物复合物或微聚合物复合物。
ABC方法的早期使用依赖于生物素化二级抗体和亲和素-生物素报告酶复合物。由于亲和素是四价的,所以会形成大的络合物,从而产生高信号强度。
现在大多数检测依赖于ABC方法的LSAB变体,该方法使用链霉亲和素而不是亲和素。这导致非特异性组织结合减少,因为链霉亲和素没有糖基化,并且具有比亲和素更中性的等电点。
查看完成LSAB ABC法IHC检测试剂盒或者自己组装试剂生物素结合二级抗体, 链霉亲和素酶结合物和显色底物试剂盒.
基于生物素的系统的关键挑战是内源性生物素可以导致某些组织中的显著背景染色(例如.,大脑)。虽然福尔马林固定和石蜡包埋会降低生物素水平,但抗原回收会导致生物素暴露。在冰冻切片中,内源性生物素是一个重要问题。虽然生物素封闭溶液的额外步骤可以用来减少背景,但基于非生物素聚合物的方法提供了一种替代方法。早期的聚合物方法使用多酶分子和次级抗体附着的葡聚糖骨架。
高级微聚合物/致密聚合物方法使用较小的检测复合物,不易聚集。通过更好的组织渗透性和减少内源性生物素的背景染色,提高了灵敏度。
查看完成微聚合物IHC检测试剂盒或者自己组装试剂HRP-聚合物结合二级抗体和显色底物试剂盒.
如果对多个抗原感兴趣,则可以使用不同的有色色素同时染色多达三个不同的抗原。这通常需要在不同物种中培养一级抗体,除非抗原的水平足够高,可以使用与报告酶直接结合的一级抗体。
也可以使用阻断剂,使特定物种中产生的一种一级抗体能够染色,然后阻断该一级抗体上的二级抗体结合位点,然后用同一物种中生成的二级一级抗体进行染色。
查看套件,用于多色显色IHC.
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