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无信号或微弱带
如果你的印迹上包括分子量阶梯在内的所有条带都很难看到,这可能表明你的技术有问题,而不是你试图检测的蛋白质。熟悉协议并检查以下常见陷阱。
可能的原因
解决方案
蛋白质转移到膜的问题。
在免疫染色之前,使用可逆染色法(如Ponceau S)检查转移是否成功。
如果蛋白质没有有效转移,检查转移方向是否正确(参见图表).
如果使用PVDF膜,请确保在甲醇中预橡膜,然后在转移缓冲液中预橡木膜。
台阶之间洗得太多。
步骤之间有必要使用缓冲液清洗,但有时过度清洗可能会去除检测试剂。减少清洗步骤的持续时间或次数。
清洗或培养缓冲液被细菌污染。
使用新鲜、无菌的缓冲液(例如无菌PBS).
试剂可能因储存和处理不当而失去活性。
查看数据表上产品的存储说明。避免过度冷冻/解冻。
如果使用荧光检测,荧光灯可能会因过度曝光而损坏。在黑暗中储存和处理荧光团和荧光团结合抗体,并用箔纸包裹小瓶,以减少光线照射。
您可能使用了错误的过滤器设置进行检测。
确保将仪器设置为读取正确的波长。
成像斑点时可能没有足够的曝光时间。
尝试用更长的曝光时间再次成像污点。这可能需要一些优化才能实现。
如果只有样品通道很难看到,分子量阶梯不受影响,这表明检测感兴趣的蛋白质存在问题。
一级抗体和二级抗体不相容。
确保使用针对主要抗体种类的二级抗体。确保一级和二级的同型是相容的。
没有足够的抗体与蛋白质结合。
添加较高浓度的一级抗体将样品与抗体在4°C下培养更长时间(如过夜)。
感兴趣的蛋白质不存在。
运行阳性对照。查阅科学文献,看看你的细胞系中是否含有这种蛋白质。
蛋白质不足。
确保每条通道至少装载20–30µg蛋白质,使用蛋白酶抑制剂,并运行推荐的阳性对照。使用浓缩步骤最大化信号(例如为核蛋白制备核裂解物)。
抗体的过度使用降低了其效力。
确保每次实验都使用新鲜的一级和二级抗体;每次使用后有效抗体浓度降低。
缓冲区可能与检测方法不兼容。
一些缓冲液含有可能干扰检测的试剂。例如,叠氮化钠是HRP的抑制剂,因此不适合与HRP结合抗体一起使用。检查缓冲液中没有任何不相容的试剂,必要时更换缓冲液。
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二级抗体可以非特异性结合
在没有任何初级抗体的情况下进行对照。确保使用不同物种的二级抗体作为样本。尝试一种二级抗体,它已经被预先吸附在样品的lg中。
初级抗体浓度可能过高。
将抗体进一步稀释至最佳浓度。
二级抗体可能与封闭试剂结合。
在培养和清洗缓冲液中添加温和的清洁剂,如吐温20。请注意,由于磷酸蛋白酪蛋白的存在,磷酸特异性抗体可能与阻乳剂发生反应。如果使用磷酸特异性抗体,请使用BSA而不是牛奶进行阻断。
非特异性结合的阻断可能是不够的。
增加阻塞潜伏期,并考虑更换阻塞剂。
我们建议在室温下封闭3-5%的非脂肪干乳、BSA或正常血清1小时。
培养温度可能过高。
确保在4°C温度下培养样品。在整个western blot过程中保持冰敷。
台阶之间没有足够的清洗。
步骤之间残留的未结合抗体或其他试剂可能会产生高背景。
在所有步骤之间的缓冲区中广泛清洗。
如果使用荧光检测,请确保在免疫染色前去除蓬松S,因为这可能会产生自荧光。
底物过多(如果使用酶结合抗体)。
稀释基质并缩短基质培养时间。
信号放大可能过高(如果使用信号放大技术)。
减少信号放大量(例如,如果使用生物素化,将较少的生物素偶联到二级抗体)。
污点已经干了。
通过将膜覆盖在缓冲液中,防止膜在培养过程中干燥。
成像斑点时,曝光时间可能太长。
尝试用较短的曝光时间再次成像污点。这可能需要一些优化才能实现。
你选择的滤膜可能会有较高的背景。
硝化纤维膜通常比PVDF提供更少的背景;如果背景仍然很高,可以考虑使用硝化纤维素膜。
蛋白酶可能消化了蛋白质。
添加蛋白酶抑制剂以防止蛋白质降解。
蛋白质可以形成多聚体。
如果你在高分子量上看到额外的谱带,而这些谱带的重量是预期谱带重量的2倍或3倍,那么这很可能发生。如果样品没有充分还原,由于二硫键的形成,一些蛋白质将形成二聚体、三聚体或更大的多聚体。为了防止出现这种情况,请尝试在样品制备.
该蛋白可能具有多种异构体或翻译后修饰
由于翻译后修饰(PTM),如磷酸化和糖基化或选择性剪接变异体,许多蛋白质显示的条带分子量略高于预期。查看文献,查看是否报告了多个波段。为了确认额外的谱带是由PTM引起的,您可以通过用合适的试剂处理样品来分解修饰的蛋白质。例如,PNGase F可以去除糖基化。在进行另一次印迹时,额外的条带应消失。
细胞系可能传代次数过多。
经常传代的细胞株在蛋白质表达谱上逐渐积累差异回到原始的未经攻击细胞系,并行运行这些样本。
这些条带可能是非特异性的。
在可能的情况下,使用封闭肽区分特异性和非特异性条带。只有特定的波段应该被屏蔽(从而消失)。
抗体未经纯化。
一些抗体形式相对不纯,可能含有额外的蛋白质。
如果可能,使用亲和力纯化过的抗体。
封闭试剂聚集在一起,抗体与之结合。
这种结合将显示为阳性信号点。过滤堵塞剂。
凝胶或试剂被细菌污染。
确保使用新鲜、无菌的缓冲液(例如无菌PBS).
在转移过程中,气泡被截留在膜上。
气泡将显示为不均匀的白点。确保清除凝胶和膜之间的气泡转移.你可以用一个小的滚筒.
在检查了与蓬索S的转会成功后,你应该能够看到任何泡沫。
凝胶运行时间过长。
在进行阻断和免疫染色之前,请检查转移用Ponceau S将蛋白质转移到膜上。
如果所有条带都很低,则可能是蛋白质停留太久而无法通过凝胶迁移。
在继续之前,再次尝试短时间运行凝胶。
凝胶中没有足够的丙烯酰胺。
如果缓冲液中没有足够的丙烯酰胺,斑点上的条带可能会很低。
这是因为蛋白质没有经历足够的阻力,所以在凝胶中迁移太快。
你通常应该在含有较高比例丙烯酰胺的凝胶中运行低分子量蛋白质。
检查这张桌子建议的凝胶配方,并在必要时增加丙烯酰胺的用量。
凝胶运行时间不够长。
如果所有条带都很高,则蛋白质可能没有足够的时间在凝胶中迁移。
继续之前,请尝试将凝胶运行更长时间。
凝胶中丙烯酰胺过多。
如果缓冲液中丙烯酰胺过多,斑点上的条带可能会很高。
这是因为高丙烯酰胺密度会阻碍蛋白质通过凝胶的有效迁移。
一般来说,你应该用较低比例的丙烯酰胺来运行分子量较高的蛋白质。
检查这张桌子建议的凝胶配方,并在必要时减少丙烯酰胺的用量。
迁移期间电压可能过高。
如果电压过高,迁移将发生得太快。检查协议建议电压,必要时降低电压。
凝胶在迁移过程中可能过热。
如果温度过高,缓冲液的pH值可能会略有改变,这可能会影响迁移。在4°C下运行凝胶:在冰上或在寒冷的房间中。
凝胶聚合不均匀。
当凝胶没有正确聚合时,条带可能会出现不稳定或不均匀。在极端情况下,探测到的同一蛋白质的泳道可能出现在不同的分子量下(见上图)。
检查凝胶配方,看看你是否添加了适量的TEMED。查看我们建议的凝胶配方在这里.
确保凝胶在凝固时完全覆盖在缓冲液中。
初级和次级抗体浓度可能过高。
如果抗体浓度很高,那么底物会很快被消耗掉。这意味着在这一点上几乎没有光线被吸收,当你成像污点时会出现一条白色条纹。将抗体稀释至最佳浓度。