用磷酸盐缓冲盐水清理大脑并用4%多聚甲醛灌注固定,用30%蔗糖在10%中性缓冲福尔马林溶液中冷冻/后固定。将大脑冷冻在冷冻基质中,并在-80°C下储存,然后在低温恒温器上切片至30µm。切片后,将组织保存在Millonigs工作液中,直到进一步处理。切片在PBS中清洗三次,每次10分钟,然后在80°C的Tris-EDTA缓冲液(pH 9.0)(10 mM Tris,1 mM EDTA,0.05%Tween20)中对自由漂浮切片进行表位检索(HIER)。需要注意的是,HIER在80°C下持续45分钟会产生更清晰的信号,但会对大脑切片造成一些损伤。让组织冷却20分钟,然后用0.1%的PBS-Tween清洗10分钟,并在室温下封闭(5%驴血清、0.5%牛血清白蛋白、0.1%PBS-Triton X100)2小时。脑切片在4°C的封闭缓冲液中以1:1000稀释的一级抗体孵育过夜。第二天,用0.1%PBS-Tween清洗切片,用PBS清洗两次,每次10分钟,然后用1:5000 AlexaFluor驴抗兔594(ab150076)在封闭缓冲液中孵育2小时。然后用0.1%的PBS-Tween和两次PBS清洗纸巾10分钟,然后安装和盖上盖子。