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使用ChIP指南下载研究表观遗传学
如果您是ChIP新手或希望提高此技术的技能,请查看我们的免费在线ChIP培训.
染色质免疫沉淀(ChIP)是一种强大的技术,允许研究人员在自然环境中检查表观遗传调节物和DNA之间的相互作用。通过ChIP,研究人员可以识别特定的基因和序列,在这些基因和序列中,感兴趣的蛋白质在整个基因组中结合,为其调节功能和机制提供关键线索。通过剖析蛋白质-DNA相互作用的时空动力学,ChIP提供了对核心生物过程和疾病病理学的见解。
ChIP具有非常广泛的用途。从研究序列特异性蛋白质结合到全球调控过程,ChIP为研究人员提供了整合发现和绘制复杂表观遗传调控系统综合图的工具。
ChIP在阐明基因调控、转录机制和染色质结构方面发挥了核心作用。以下是一些可以使用ChIP检测的关键蛋白质。
转录因子通过研究特定转录因子在基因组中的结合位置和时间,研究人员确定了特定的结合位点和序列,精确定位了下游基因激活,并揭示了转录因子的全基因组调控程序。
ChIP和其他方法的进一步研究表明,这些转录因子是疾病病理学背后的主要调节因子,在疾病病理学中,它们协调表观遗传失调,导致癌症自身免疫性疾病、过敏等。通过识别这些主调控因子及其下游遗传程序,ChIP为针对各种疾病的诊断和治疗策略提供了新的靶点。
转录机制。ChIP研究检测RNA聚合酶II和其他转录组分的结合,揭示启动子和增强子序列以及转录调控的新机制。
染色质结构。ChIP研究在组蛋白密码的发现和表征中至关重要。通过绘制特定组蛋白修饰的位置并与已知的基因激活状态进行比较,研究人员记录了特定组蛋白残基上的乙酰化或甲基化如何影响基因激活或沉默和更高阶染色质结构。这些组蛋白修饰特征现在可用于通过ChIP预测基因组特定区域的表观遗传调控。
随着新的组蛋白修饰和染色质调节元件的发现,ChIP仍然是揭示这些元件在基因组调控中的功能及其相互作用复杂性的重要工具。
组合分析
结合多个蛋白质的ChIP分析是构建基因组调控完整图景的有力方法。这种方法使研究人员能够研究不同类型的蛋白质和蛋白质复合体如何在特定位置沿特定基因或整个基因组在空间和时间上相互作用,以调节基因转录(Barski等人,2007年)。
ChIP扩大了表观遗传学研究的范围和精度
ChIP以无与伦比的精确度促进了在各种尺度上对表观遗传机制的分析。这些是使用ChIP可以实现的一些功能。
局部表观遗传机制
全基因组表观遗传编程
动态表观遗传过程
ChIP程序利用抗体免疫沉淀感兴趣的蛋白质,如转录因子及其相关DNA。然后通过PCR、微阵列或测序恢复并分析相关DNA,以确定基因组序列和蛋白质结合的位置。
该过程可分为五个部分(图6)。
图1:ChIP协议工作流。实施ChIP实验的分步方法
1.交叉链接
在某些情况下,可能需要DNA和蛋白质的交联来稳定它们的相互作用,特别是对于作为大型蛋白质复合体的一部分相互作用并且不直接接触DNA的蛋白质。交联固定了这些分子间的相互作用,并在特定时间点将其冻结,称为交联ChIP(X-ChIP)。相反,天然ChIP(N-ChIP)是在没有事先交联的情况下进行的。
交联通常是用甲醛进行的,甲醛可逆地将蛋白质交联到DNA、RNA和其他蛋白质上。其他化学物质,如顺铂,只能用于DNA和蛋白质之间的选择性交联。研究DNA和特别是大型蛋白质/RNA复合物之间的相互作用可能需要使用额外试剂进行双重交联。UV交联是不可逆的,因此与ChIP不相容。
2.染色质片段化
染色质必须被切成小块,以进行有效的免疫沉淀和将靶抗原精确定位到基因组。DNA片段的大小将最终决定基因组作图的分辨率,因此优化片段化方案非常重要。
步骤1和2对于优化每个实验以获得最高质量的DNA以进行后续ChIP分析非常重要。
3.免疫沉淀
然后将感兴趣的蛋白质和与其结合的DNA片段进行免疫沉淀。染色质混合物与对感兴趣的蛋白质的抗体以及琼脂糖或磁珠在4℃孵育过夜o个C形成珠/抗体/蛋白质/DNA复合物。然后通过离心收集蛋白A、蛋白G或蛋白A/G琼脂糖珠,或通过磁管架收集磁珠,以免疫沉淀抗体/蛋白/DNA复合物。随后进行清洗,去除非特定的束缚。
4.DNA回收和纯化
抗体/蛋白质/DNA复合物用SDS和加热从珠中洗脱。蛋白质和DNA的交联必须用氯化钠和加热进行X-ChIP实验。然后用蛋白酶K和核糖核酸酶A降解存在的任何蛋白质和RNA,用酚氯仿提取或PCR纯化试剂盒纯化剩余的DNA。
您可以在这里找到完整的X-ChIP协议
这里还有我们的N-ChIP协议
5.分析DNA
然后通过qPCR、杂交阵列(ChIP-on-ChIP)或下一代测序(ChIP-seq)分析纯化的DNA,以识别和量化免疫沉淀的序列。这些序列被映射到基因组,以确定感兴趣的蛋白质结合的基因和区域。
交联的目的是将感兴趣的抗原固定到其染色质结合位点。组蛋白本身通常不需要交联,因为它们已经与DNA紧密结合。其他与DNA或组蛋白亲和力较弱的DNA结合蛋白可能需要交联来固定它们。
染色质断裂差异
虽然N-ChIP和X-ChIP都需要染色质碎裂以使抗体能够进行相互作用,但它们分别需要利用微球菌核酸酶或超声波作用的不同碎裂程序(Neill等人,2003年)。
N-ChIP:对于N-ChIP实验,使用微球菌核酸酶进行酶消化应能将样品充分分割成单个核小体(包含约175个碱基对的单体)。
•纯化的单体不适合分析与某些染色质结合物(如转录因子)的相互作用,转录因子通常与核小体间DNA结合。对于这些情况,建议使用超声波。
•核小体是动态的,在酶消化过程中可能会重新排列。这对于绘制基因组的某些区域可能是一个问题,任何变化都应该用适当的控制来监测(参见定量PCR的检测控制)。应进行X-ChIP作为对照,以评估在无交联的情况下任何动态和不需要的变化。
•酶切不会产生完全随机的染色质片段。微球菌核酸酶倾向于基因组序列的某些区域而不是其他区域,并且不会均匀或同等地消化DNA。某些基因座可能代表性过高,而其他基因座可能不存在,这可能会影响数据的准确性。
•为了获得消化的一致性,在购买后使用小份原液酶,并在每次进行实验时使用新鲜小份酶进行新的时间进程。虽然酶的质量在储存过程中可能会随时间而变化,但染色质制剂的变化风险(压实度等)要高得多;一个染色质样本不应被视为与之前的所有其他染色质样本相同。
X-ChIP(X-ChIP):甲醛交联限制了酶(如微球菌核酸酶)到达其靶点的途径,使酶消化在X-ChIP实验中无效。相反,超声处理用于产生500-700个碱基对的随机DNA片段(2-3个核小体)。
•避免起泡,因为起泡会减少溶液中的能量传递,降低超声波效率。声波也可能受到交联时间、细胞密度或细胞类型的影响。
•虽然超声染色质可以在液氮中进行snap冷冻,并在-80°C下储存长达两个月,但应避免多次冻融循环。
•虽然超声波理论上不会显示出基因组的优先裂解,但在实践中很少出现这种情况。
•DNA片段大小通常较大,影响分析的分辨率。无论如何,高达1.5 kb的片段在ChIP中的大多数用途中都能很好地解析。微球菌核酸酶消化结合超声处理可以提高分辨率,并且可能对温和或不完全交联样品有用。
无论选择哪种破碎方法,在设置实验时始终运行破碎时间过程以优化碎片大小是很重要的。
表1:N-ChIP与X-ChIP的优缺点。
染色质免疫沉淀
优势
DNA和组蛋白的高效沉淀
对于非组蛋白。可在所有细胞类型、组织和生物体上进行。
绑定的特定性更容易预测
实现DNA-蛋白质、RNA-蛋白质和蛋白质-蛋白质交联
高分辨率(~175bp/单核小体)
减少染色质重排的机会
缺点
仅用于组蛋白
过度固定会阻止有效的声波作用
选择性核酸酶消化可能会使输入染色质产生偏差
甲醛可以改变抗原的结合特性
高浓度核酸酶可能过度消化染色质
与N-ChIP相比分辨率更低
并非所有抗体都适用于ChIP实验,许多抗体不具备ChIP质量,也不适合用于ChIP应用。选择正确的ChIP颗粒抗体对您的ChIP实验的成功至关重要。
如果市面上没有,或者如果您想尝试未经ChIP测试的抗体:
ChIP协议和数据分析可能很复杂,因此关键是要包括正确的控制,以确保实验按预期工作。
样品对照
至关重要的是,在所有DNA回收步骤中加入一个未经免疫沉淀的输入样品控制,以与下拉样品结果进行比较。最终,正是这种比较使数据标准化,以提供可解释的结果。
当免疫沉淀用于组蛋白修饰时,纯化组蛋白H3和H1可用作组蛋白制剂质量的阳性对照(组蛋白H1通常用于X-ChIP)。同时,小牛胸腺组蛋白制剂应作为阳性对照组蛋白样品,用于检测免疫印迹的抗体特异性。
抗体控制
各种抗体控制对于确保免疫沉淀成功和排除污染的可能性非常重要。以下是一些关键控件的示例:
此外,染色质重塑可能移动或移除特定位点(如活性启动子)的组蛋白。为了确认核小体在特定基因组位点的保存,使用针对非修饰组蛋白(如组蛋白H3)的对照抗体。分析组蛋白修饰时,使用抗H3抗体将组蛋白含量正常化。
定量PCR控制
如果通过qPCR分析数据,则有必要进行额外的控制,以确保数据分析的质量。基因组的某些区域将比其他区域净化得更好,一些核小体可能在酶切过程中重新排列。因此,重要的是为起始材料中的几个区域以及纯化的/ChIP材料生成PCR引物,以控制虚假结果。通过裂解起始细胞生成起始材料,并在与ChIP平行的对照区进行简单PCR取样。
此外,在qPCR阶段,对已知感兴趣的蛋白质应该或不应该结合的基因组位点进行阳性和阴性对照qPCR是至关重要的。还需要进行非模板对照qPCR作为阴性对照,以确保PCR中没有污染。
图2:超声波时间过程实验示例。将U2OS细胞超声处理5、10、15和20分钟。交联被逆转,纯化的DNA在1.5%琼脂糖凝胶上溶解。碎片大小在时间过程中减小。在15分钟时观察到最佳碎片大小。
抗体浓度。重要的是要对抗体进行滴度以优化信噪比。开始时,每25–35 mg纯单体需要3–5µg抗体。对于定量ChIP,您可能需要将染色质的数量与相同数量的抗体相匹配。ChIP通常需要大量的一级抗体(1-10µg/ug珠子)。与许多技术一样,在开始实验之前优化抗体的数量是至关重要的。
清洗缓冲液.确定清洗步骤的正确成分,通常在250–500 mM NaCl或LiCl之间。较高浓度的盐和洗涤剂将产生更清洁的效果。然而,必须在低背景和对目标的有害影响之间取得平衡。如果缓冲液过于严格,就会破坏特定的抗体相互作用,导致低信号。如果缓冲区不够严格,非特定相互作用将继续存在,从而导致高背景。NP-40可用作洗涤剂,而RIPA通常用于X-ChIP。
标准ChIP工作流需要大量单元格。大约106到107细胞作为起始材料,在其下方,分析受到高背景结合、低富集效率和富集文库复杂性损失的阻碍。然而,这些大样本量可能很难获得,特别是在检测珍贵的样本类型时,如转基因小鼠组织或临床样本。为了调整较低的样本输入,可以应用一些策略。
1.提高富集效率,减少样品损失
对ChIP工作流程进行几次调整可以提高富集效率,并将低输入样品的样品损失降至最低(Mao等人,2013年和Dirks等人,2016年)。
2.读数和下游数据处理平台
除了分析本身,下游处理(即测序、阵列或PCR)和生物信息分析的选择和优化也很重要。
研究特定组织中的表观遗传机制可以揭示组织特异性遗传规划、发育和生物过程的基本要素。ChIP可以作为一种有价值的工具,用于研究组织特异性转录因子的作用和机制、基因激活和表观遗传调控的其他方面。从组织样本中进行ChIP需要专门的染色质制备协议,以确保输入材料的质量和结果的可靠性。
所需的组织数量取决于蛋白质丰度、抗体亲和力和交联效率。使用5–15µg染色质对每个ChIP分析进行优化,使用30 mg肝组织对每个ChIP/抗体进行优化。在开始X-ChIP分析之前,应确定每种组织类型的准确染色质浓度。
点击此处查看我们的组织样本ChIP协议。
即使进行了优化,第一次尝试的结果也可能并不完美。在这里,您可以找到一些常见的问题和解决方案,可以用来解决这些问题。
非特异性抗体控制背景高
潜在问题
解决方案
珠子的非特异性结合
添加其他洗涤液
或
在免疫沉淀之前,将声波染色质与蛋白a/G珠孵育1小时,添加预清除步骤
珠子提供高背景
尝试不同品牌的珠子和不同的阻挡策略,看看哪种方法能为你的非特定控制提供最低的背景
受污染的清洗缓冲液
更换缓冲器
低信号
细胞未被有效裂解
RIPA缓冲器应工作良好
起始材料不足
ChIP通常需要大量输入,每个IP条件下至少25µg染色质(3-40万个细胞)
染色质片段大小可能太小
在凝胶上运行以确保大小正确,必要时重复碎片优化
抗体不足
3–5µg通常就足够了,但如果没有观察到信号,则可能需要多达10µg
单克隆抗体可能不适合,尤其是X-ChIP,因为交联可能掩盖表位
尝试使用多克隆抗体或ChIP级/批准的单克隆抗体
洗涤缓冲液过于严格,消除了特定抗体结合
缓冲液中的NaCl不应超过500 mM。清洗缓冲液应如上所述进行优化
错误的亲和珠
如果不分析组蛋白,N-ChIP可能不适用
如果使用X-Chip,细胞可能交联时间过长,降低了表位的可用性,或者时间不够长,减少了IP中DNA的下拉
确保抗体种类和免疫球蛋白结合到选定的珠或使用蛋白/AG混合物
分析DNA亲和力较弱的蛋白质时可能需要X-ChIP,以使蛋白质与DNA交联
进一步优化交联时间进程
注:低信号可能是真实的,在感兴趣的区域没有抗体富集。
包括阳性对照抗体和位点,以确认ChIP有效。
抗原可能存在,但不在预期的基因组位点。
大区域高背景低分辨率
DNA片段大小可能太大
片段大小应小于1kb,但理想情况下为200-1000bp。MNase消化到175 bp的单个核小体水平可以获得最佳分辨率。在凝胶上运行,必要时进一步优化染色质破碎步骤。
PCR扩增问题
PCR后所有样本中的高信号,包括非模板对照
qPCR溶液可能被污染
从库存中制备新溶液
样本中没有DNA扩增
底漆可能不起作用
包括输入DNA控制
其他哪些治疗可能会影响我的ChIP结果?
一些抗体受到相对低浓度SDS的影响。TSA、丁酸盐或colcemid的添加通常不会影响ChIP。
不要在高转速下离心分离珠子(不要超过6000 rpm),因为这样会压紧珠子并损坏珠子。
一旦提取下来的DNA片段经过免疫沉淀和纯化,就可以用几种不同的方法进行分析。
定量PCR
利用基因或目标特异性引物扩增下拉DNA中的已知目标位点
限制:
芯片上的ChIP
使用微阵列检查基因组中许多感兴趣的位点、特定域等的存在。将下拉样品和对照样品放大,并用互补荧光探针标记。将样本组合并杂交到感兴趣的微阵列。荧光信号的比率表示感兴趣的蛋白质结合的富集区域。
ChIP-seq公司
最常用的全基因组分析方法,具有改进的基面分辨率,且不受ChIP-on-ChIP的限制。扩增下拉DNA和对照样品,然后对片段进行高通量测序,然后将其与基因组对齐。重叠的片段形成一个峰值,表明感兴趣的蛋白质与基因组结合的位置。
图3:ChIP序列概述。执行ChIP后,沉淀的DNA可用于文库准备、测序,然后将这些序列映射到参考基因组,然后进行峰值调用以确定感兴趣的蛋白质的结合位点。
应始终针对起始材料的数量对数据进行标准化,以消除因样本数量不均匀而产生的误差。为了规范化数据,取最终的振幅值,并将其除以输入材料的振幅值。对于组蛋白修饰,免疫沉淀物质通常归一化为输入量和相关免疫沉淀组蛋白的量。例如,带有H3K4me3抗体的ChIP将相对于输入量和H3免疫沉淀量进行表达。
衡量起始材料的数量(和质量)是有效解释结果的关键。
虽然ChIP-seq数据分析可能很复杂,但可以说它是实验中最重要的部分。稳健的数据分析是准确可靠结果的关键。在线工具的组合使得生物信息学专家和湿实验室生物学家都可以进行数据解释。 有许多资源演示如何从ChIP-seq数据中提取可靠的结果,以及如何解释成功的ChIP-seq分析的数据集(Hurtado等人,2010年和Yan等人,2013年)。
有关ChIP-seq数据分析的分步教程,请在此处观看我们的网络研讨会。
本次网络研讨会涵盖以下ChIP-seq数据分析工作流程:
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