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表观遗传学领域正在开辟许多令人兴奋的新途径。其中一个途径是RNA修饰研究领域。RNA修饰检测和测序方法发展的最新进展,例如m6A个体核苷酸分辨交联和免疫沉淀(miCLIP),意味着在任何细胞类型或模型生物体内发现新的修饰并将其映射到不同种类的RNA变得越来越容易和快速。这项技术的进步导致了已知RNA修饰数量的激增。目前,已知的RNA化学修饰有100多种(Roundtree等人,2017年)。你可以在mRNA、tRNAs、rRNAs和包括miRNAs在内的其他非编码RNA上找到这些。每个修饰都有自己的功能,包括RNA结构、输出、稳定性和mRNA剪接。这一研究领域的前景是光明的;对于这些新修改中的一些功能,仍有许多需要揭示的地方。
图1。RNA修饰在mRNA和tRNA上的分布。要了解更多信息,请查看我们的RNA修饰海报
在所有的RNA物种中,tRNAs含有最多的RNA修饰:tRNA中几乎有五分之一的核苷酸被认为含有RNA修饰(Kirchner等., 2015). tRNA的修饰极其多样,需要多种酶逐步形成7你通常可以在tRNA的反密码环中发现修饰,这有助于通过辅助密码子-反密码子相互作用和防止移码来提高翻译效率(斯图亚特等., 2003).
RNA修饰领域相对较新,但每天都在增长。在本节中,我们将介绍其中一些协议,并提供一些有关RNA修改的提示和建议。
获得特定于你选择的RNA修饰的抗体可能很困难。我们有许多被广泛引用和验证的RNA修饰抗体,包括我们的m6A抗体,这些抗体在一些重要的出版物中被引用,包括《自然方法》的一篇论文,该论文将其用于m6A的单碱基分辨率测序(Linder等., 2015). 同样的m6A抗体也出现在《自然》杂志的一篇论文中,研究m6A在mRNA稳定性中的作用(Mauer等., 2017).单击此处获取我们的RNA修饰抗体的完整列表。
RNA修饰抗体:技术考虑抗体特异性和一致性。重要的是要确保您正在使用的抗体针对您感兴趣的修改,即使用正确的控件并在模型系统中测试抗体。一旦你有了有效的抗体,你应该确保在不同批次之间你仍然能获得特异性。重组RabMAb®该技术通过在每一轮抗体生产中使用相同的免疫原来消除批间差异。这将在整个项目中为您提供一致的抗体和可重复的结果。我们的许多RNA修饰抗体是RabMAb®单克隆抗体包括关键靶点,如m6A、m1A、Mettl3、m2,2G等。
RIP是一种基于抗体的技术,用于绘制地图体内RNA与蛋白质的相互作用。感兴趣的RNA结合蛋白(RBP)与其相关RNA一起进行免疫沉淀,以鉴定结合转录物(mRNA、非编码RNA或病毒RNA)。转录物通过实时PCR、微阵列或测序检测。
除了转录和随后的翻译之外,RNA的功能还有很多。例如,RNA-蛋白质相互作用可以调节mRNA和非编码RNA的功能。这种对RNA潜力的新认识导致了新方法的发展,使研究人员能够绘制RNA-蛋白质相互作用图。RIP是研究单个蛋白质和RNA分子之间物理联系的一种协议。
看看我们完整的RIP协议。
改编自Khalila等(2009),亨德里克森等(2009),亨德里克森等(2008)和Rinn等. (2007).
图2。RIP协议工作流示意图。Top使用原生方法,无需交联。底部方法使用甲醛交联。
RIP:技术考虑核糖核酸酶污染。避免使用无RNase试剂(如无RNases针头、试管和试剂瓶)造成污染。使用超纯蒸馏、无DNA、无RNase的水制备缓冲液和溶液。
仔细规划控制。在整个实验过程中应保持一个或多个阴性对照,如无抗体样本或敲除细胞或组织的免疫沉淀。阴性对照实验不建议使用敲除细胞。
下游分析。从下拉菜单中分离出的RNA可以使用多种技术进行分析。根据你想回答的问题选择最佳方法,并使用多种方法确认结果。例如,您使用RIP-seq获得的任何新结果都应该使用RIP-qPCR进行确认。
CLIP是一种基于抗体的技术,用于研究与RNA免疫沉淀(RIP)相关的RNA-蛋白质相互作用,但与RIP的不同之处在于,它使用紫外线辐射将RNA结合蛋白与RNA交联。这种共价键是不可逆的,允许严格的纯化条件。与RIP不同,CLIP提供了RNA上实际蛋白质结合位点的信息。
存在不同类型的CLIP,包括高通量序列分析CLIP(HITS-CLIP)、光活化核苷增强CLIP(PAR-CLIP)和个体CLIP(iCLIP)。
你可以找到我们的此处显示完整的CLIP协议改编自科尼格等.J.视觉。2011年到期。“iCLIP-蛋白质-RNA相互作用与单个核苷酸分辨率的转录组宽映射。”
图3。CLIP协议工作流示意图。
CLIP:技术考虑
4-硫尿苷预培养。某些蛋白质可能需要选择性的4-硫尿苷预孵育和UV-A交联。4-硫尿苷可增强某些蛋白质的交联。有关详细信息,请参阅完整的协议。优化抗体浓度。在开始实验之前,应优化所需的抗体量(Huppertz等人,2014)。无抗体样本是良好的阴性对照。如果您感兴趣的目标之前没有使用CLIP进行过研究,您可以首先使用已经在IP中起作用的抗体,这很好地表明它将在CLIP中起到作用。
虽然m6A是真核生物mRNA中最丰富的修饰碱基,但目前精确研究它的方法有局限性。m6A高分辨率定位的新方法对于理解这种表观遗传RNA修饰至关重要。
miCLIP允许高分辨率检测单个m6A残基和m6A在整个RNA上的聚集(图14)。使用miCLIP,可以在人和小鼠mRNA(Linder)中以单核苷酸分辨率绘制m6A和相关的二甲基化m6Am(N6,2′-O-二甲基腺苷)等., 2015).
miCLIP适用于较小的RNA。本协议的作者(Linder等.,2015)发现m6A存在于小核仁RNA(snoRNAs)中,这是一类小的非编码RNA。由于缺乏特异性和生物信息学挑战,这在以前的应用中是不可能实现的。
您可以在这里找到完整的miCLIP协议。
miCLIP:技术考虑
不是100%准确。该方法无法确定改性残留物的具体位置,只能确定m6A位点的大致位置。
生物信息m6A调用中的偏差数据分析使用了基于已知共有序列的假设,这些序列含有m6A残基,因此忽略了这些基序之外的修饰。
图4:miCLIP协议工作流示意图
与DNA修饰类似,如果你可以使用LC-MS/MS,那么这是量化总基因组DNA中RNA修饰量的最佳方法。同样,与测量DNA修饰类似,你可以使用绝对定量方法,这种方法仅受你可用的同位素标准作为标准来测量样品的限制。
将这项技术与RIP(RIP-MS)相结合,可以确定你的RNA修饰抗体是否与你感兴趣的修饰结合,并观察它是否与任何其他非特异性修饰结合。如果您生成RIP输入和下拉样本的LC-MS/MS数据,您应该会看到与输入相比,下拉样本中您感兴趣的修改有所增加。然后,您还可以使用这些相同的数据检查其他修改,以查看在您的样本中是否出现了其他浓缩的东西,以测试非特异性抗体结合。
LC/MS-MS:技术考虑技术上具有挑战性。大规格设备价格昂贵且非常专业。机器本身需要大量的维护,通常需要自己的技术人员来控制。操作机器非常复杂,需要专门的培训,因此可能很难独自获得此类质量规格数据。如果您不可能购买自己的LC/MS-MS设备,请考虑通过合作或付费服务获取此数据。
由于RNA修饰的性质,它们的化学结构通常非常相似。为了确保从抗体中获得最准确的结果,您需要在模型系统中对其进行彻底测试。RNA修饰抗体的控制可以使用一系列的应用来完成。请参阅下面的一些高级控制和提示,以简化您的RNA修改研究。
核糖核酸酶处理
无论你是在进行ICC/IHC还是RIP-qPCR,在你的实验样品旁边有一个RNA酶处理的对照物是至关重要的(Delatte等., 2016). 例如,如果你在实验性IHC样品中看到一个清晰明亮的信号,但在RNAse处理的对照样品中没有信号,你可以确信你得到的信号是在RNA中,而不是来自非特定来源的背景信号。这表明抗体识别RNA内的修饰,而不是DNA内的修饰。
无论是进行ICC/IHC还是斑点杂交,都必须在实验样品旁边放置一个RNA酶处理的对照物,以确保在使用RNA修饰抗体时不会从DNA中拾取非特异性背景信号。例如,如果你在实验性IHC样品中看到清晰明亮的信号,但在RNA酶处理的对照样品中没有信号,你可以确信你得到的信号是来自RNA,而不是来自非特定来源的背景信号。这表明抗体识别的是RNA内的修饰,而不是DNA内的修饰。
您可以在常规RNA修饰IHC、RIP或斑点杂交协议中快速添加RNase处理步骤。
DNA酶处理
除了RNase处理的控件外,还应执行DNAse处理的控件。如果你担心你的RNA修饰抗体识别出DNA中的类似修饰,最好的测试方法是用DNAse处理你的样本。RNA和DNA都有许多修饰,所以这是一个常见的问题。例如,DNA中的5mC与RNA中的m5C具有相同的化学修饰。
竞争分析
另一种确保RNA修饰抗体特异性的方法是使用竞争分析。本试验使用一种合成的修饰寡核苷酸,该寡核苷酸可以与抗体预先孵育(Meyer等2012年)。当您将这种预先培养的抗体用于您的应用时,例如ICC/IHC或斑点杂交,您应该会看到当将染色的样本与单独的抗体进行比较时,获得的信号会减少。你可以尝试在抗体溶液中增加竞争性寡核苷酸的浓度;信号梯度的减小反映了你添加到抗体中的竞争对手的数量。例如,尝试0 ng、10 ng、100 ng和1µg竞争性寡核苷酸的梯度。
斑点印迹
使用RNA修饰抗体进行斑点杂交可以快速简单地测试其特异性。斑点印迹的工作原理类似于简化版的西方印迹。在这种技术中,样品直接被点在膜上,交联,然后进行吸液。更多细节请看我们的斑点杂交协议。如果你能获得含有你感兴趣的修饰物的合成RNA分子,这可以作为完美的阳性对照。类似地,加载未修饰的分子或包含不同修饰的分子可以作为阴性对照,帮助您测量任何非特异性结合或交叉反应性。
RIP-MS系统
如果你能使用LC-MS/MS,那么这确实是测试RNA修饰抗体特异性的最佳方法(Kellner等., 2014). 使用这项技术结合RIP(RIP-MS)可以让你确定你的抗体是否与你感兴趣的修饰物完全结合。
工具书类
Delatte B、Wang F、Ngoc LV、Collignon E、Bonvin E、Deplus R、Calonne E、Hassabi B、Putmans P、Awe S、Wetzel C、Kreher J、Soin R、Creppe C、Limbach PA、Guaydan C、Kruys V、Brehm A、Minakhina S、Defrance M、Steward R、Fuks F.RNA生物化学。RNA羟甲基胞嘧啶的转录组分布和功能。(2016)科学。2016 15:282-5
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