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在整个DNA中,化学修饰为DNA序列中编码的基因的表达增加了一层调控。这些化学修饰中研究最为深入的是5-甲基胞嘧啶(5mC),这是一种最常见的被认为是稳定的抑制性基因表达调节物的修饰。人类基因组由大约1%的甲基化胞嘧啶组成,使其成为最丰富和最广泛的DNA修饰(Moore等人,2012年)。有几种方法可用于对整个基因组中的5mC进行测序,所有这些方法都有利弊,我们将在本指南后面讨论。这些方法包括高分辨率方法,如全基因组亚硫酸氢盐测序和抗体依赖性DNA免疫沉淀(DIP)或MeDIP。
最初发现5mC位于CpG岛内,这是在富含CpG二核苷酸的启动子区域内常见的DNA延伸。正是在这些启动子区域中,5mC作为稳定的表观遗传标记抑制基因转录。在哺乳动物基因组中,甲基化胞嘧啶最初在早期发育过程中通过新生甲基转移酶DNMT3a和DNMT3b并入DNA(Okano等人,1999年)。这些甲基化标记通过附加的甲基转移酶DNMT1在整个基因组中保持不变,该甲基转移酶在DNA复制期间将DNA甲基化模式复制到子链(Vertino等人,1996年)。
今天,关于5mC是一种完全稳定的DNA修饰的概念就不那么具体了。基因组中的许多甲基化胞嘧啶,尤其是基因体内的甲基化胞苷,都会经历一个称为DNA去甲基化的过程,这一过程最终会将5mC还原为未修饰的胞嘧啶(C)。DNA脱甲基可能以两种方式之一发生:被动DNA脱甲基,即甲基化胞嘧啶因缺乏甲基化维持酶而从基因组中稀释。或活性DNA去甲基化,涉及通过十-十一易位(TET)酶将5mC氧化为5mC的氧化衍生物(Wu等人2017综述)。
活性DNA去甲基化发生在一个循环中,从5mC开始,以未经修饰的C结束。5mC最初被氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC),然后进一步氧化为5-甲酰胞嘧啶(5-fC),最后再次氧化为5-羧基胞嘧啶(5 caC)。胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)结合碱基切除修复(BER)可以从DNA中去除5fC和5caC,从而产生未修饰的C(图1)。5hmC、5fC和5caC是许多近期表观遗传学研究的重点。越来越多的人发现了这些表观遗传标记,包括它们具有稳定表观遗传作用的潜力。已经开发了许多测序方法来区分整个基因组中的这些标记,包括使用5hmC、5fC和5caC抗体的MeDIP变异,以及亚硫酸氢盐测序变异,如TET辅助亚硫酸氢序列测定(TAB-seq)。本指南稍后将讨论这些方法之间的差异。
图1。DNA去甲基化的循环。胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)结合碱基切除修复(BER)或5hmC、5fC或5caC的复制依赖性稀释,发生活性DNA去甲基化。主动修正-被动稀释(AM–PD)。主动修改-主动删除(AM–AR)。
使用传统的DNA扩增方法不可能检测到5mC,因为在样品制备和扩增过程中没有保持标记。亚硫酸氢盐转化是将DNA甲基化标记转化为适合扩增和下游分析的模板的最广泛使用的方法之一。亚硫酸氢盐转化利用NaOH和亚硫酸氢钠在化学反应中处理DNA,将胞嘧啶碱转化为尿嘧啶(U),而甲基化胞嘧啶则不受转化影响(图2)。在下游分析(如PCR或测序)过程中,在亚硫酸氢盐反应中经历脱氨作用的非甲基化C碱将被解释为胸腺嘧啶(T),而5-mC碱将保持不变,并且仍被测序输出检测为C。这允许您确定含有甲基化胞嘧啶的基因组中的位置(Frommer等., 1992)
图2。亚硫酸氢盐转化。用亚硫酸氢盐(磺化)处理DNA会导致胞嘧啶残基脱氨基并将其转化为尿嘧啶,而5-甲基胞嘧啶残余物保持不变
基于二硫化物的应用亚硫酸氢盐转化已经成为为高通量应用或更广泛的全基因组范围区域研究设计的几种变体和应用的基础。以下是一些基于亚硫酸氢盐的方法示例。全基因组DNA甲基化分析
全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS;列表器等2009)
简化表示亚硫酸氢盐测序(RRBS;迈斯纳等., 2005)
靶向DNA甲基化分析甲基化特异PCR(MS-PCR;赫尔曼等., 1996)
焦深测序(科尔拉等., 2003; 托斯特等., 2007)
高分辨率熔融(HRM)分析(Wojdacz和Dobrovic,2007)
亚硫酸氢盐转化:技术考虑
转换不完整。二硫化物转化是一种非常强大的方法,因为它相对简单,并且可以提供DNA甲基化状态的单碱基解析。然而,该方法确实存在一些缺点:在次优反应条件下可能会发生不完全转化(或有时过度转化),导致DNA变性不足,或者当DNA链在反应完成之前失去功能时。区分5hmC。DNA降解通常是严酷的亚硫酸氢盐转化反应条件的副产物,这可能会使处理较小的样品具有挑战性。反应脱硫不足会留下残留物,这些残留物可以抑制PCR中使用的DNA聚合酶。最近的证据表明,亚硫酸氢盐转化不能区分5mC和5hmC亚硫酸氢盐转化,因此降低了DNA序列的整体复杂性。这种减少序列的复杂性可能会使下游基于PCR的询问的引物设计复杂化,或者在尝试将测序读数唯一映射到参考基因组时带来挑战。
另一种常用于绘制DNA甲基化标记位置的方法是DIP。DIP在很大程度上依赖于具有能够识别感兴趣的DNA修饰的抗体。然而,一旦你有了这一点,DIP是一种简单而有效的方法。与需要对整个基因组进行测序的WGBS测序相比,它的成本更低,分析更容易。DIP只需要对IP步骤中拉下的小剪切DNA区域进行测序。DIP已成功用于最具特征的DNA修饰:5mC、5hmC、5fC和5caC(Pastor等.,2011,沈等., 2013). 它已被用于一系列样本中,包括胚胎干细胞、脑组织和斑马鱼胚胎。该方法类似于ChIP,但您的起始材料是不需要染色质的原始基因组DNA。这个基因组DNA将被剪切到大约150–300bp,然后这个被剪切的DNA可以进行热变性。这一步至关重要,因为抗体只能访问变性(开放)DNA中的修饰。 DNA变性后,剪切的DNA与识别您感兴趣的修改的抗体一起孵育,通常是在一夜之间,然后样品经过IP步骤,将所有与抗体结合的DNA拖出,并洗掉任何未结合的DNA。我们建议对这种IP步骤使用磁珠。当你进行DIP时,重要的是用RNase处理你的初始基因组DNA,以从样品中去除任何RNA。
图3。DIP方法。基因组DNA被剪切,免疫沉淀是使用针对DNA修饰的抗体进行的。下拉DNA和输入样本可用于qPCR、微阵列或NGS。
基于DIP的应用全基因组DIP分析DIP排序(牧师等., 2011)
目标DIP分析DIP-PCR(牧师等2011年)
DIP:技术考虑适当剪切样品。与WGBS不同,DIP不是单基分辨率。当你剪切DNA样本时,重要的是将这些DNA片段大小控制在150–300bp之间,以提高DIP测序的分辨率。拥有更大的片段意味着你将不可避免地从你感兴趣的DNA修饰两侧拖出更多的DNA,而不是与之物理结合。这将导致你的测序分析中出现广泛的、非特定的峰值。获得良好的抗体。DIP的另一个问题是,你需要有一种针对你感兴趣的修改的抗体。你需要确保对类似修饰有最小的交叉反应,例如,如果你的5fC抗体也能识别5hmC,这对于绘制5fC在整个基因组中的位置并不理想。使用抗体进行这类测序也有许多优点。你只会受到可用抗体的限制。如果你想研究以前DNA中没有特征的修饰,例如m6A(通常与RNA有关),你可以这样做,前提是你有一种特定的m6A抗体。
传统亚硫酸氢盐测序的最大缺点是无法区分5mC的氧化衍生物,只能对5mC本身进行分析。幸运的是,亚硫酸氢盐测序有很多变化,还有一些全新的方法来解决5hmC、5fC和5caC测序的问题。这里我们更详细地看一下这些新方法中的一些。
5hmC映射
Tet-辅助亚硫酸氢盐测序(TAB-seq;于等., 2012)
氧化亚硫酸氢盐测序(oxBS-seq;展位等., 2012)
hMe-密封。(歌曲等., 2011)
用核酸外切酶进行选择性化学标记(SCL-exo;Sérandour等., 2016)
5fC/5caC映射
M.SssI甲基化酶辅助亚硫酸氢盐测序(MAB-seq;吴等., 2014)
5fC化学辅助亚硫酸氢盐测序(fCAB-seq;歌曲等., 2013)
5caC化学辅助亚硫酸氢盐测序(caCAB-seq;卢等., 2013)
化学标记支持的C-T转换排序(CLEVER-seq;朱等., 2017)
重要的是你要选择最适合你需要的检测DNA修改的方法。考虑诸如是否需要单基分辨率、是否需要量化修改的绝对级别以及该方法在模型系统或样本类型中的可行性。您可以在下面的表格中找到我们总结了5hmC、5fC和5caC测序的一些可用方法的这些关键特性。
姓名
描述
单基地分辨率?
允许修改的绝对量化?
参考
仅5hmC映射
5hmC-下倾
使用5hmC特异性抗体富集5hmC。
不
牧师,W.A。等2011年自然
TAB-seq键
5hmC被转化为5gmC以保护它。5mC被TET酶转化为5caC。亚硫酸氢盐转化后,5hmC读数为C.5mC,5caC读数为T。
是的
Yu,M。等细胞,2012
oxBS-seq系列
使用KRuO将5hmC化学转化为5fC4允许在单个时区分5mC和5hmC
布斯,M.J。等科学,2012
hMe-密封
5hmC与含叠氮的葡萄糖分子和生物素进行葡萄糖基化,可使用生物素/链霉亲和素下拉菜单富集5hmC。
宋,C.X。等,《自然生物技术2011》
SCL-exo公司
5hmC的叠氮-葡萄糖糖基化后发生生物素反应,使得内切酶活性在生物素-5gmC处停滞。
Sérandour,A.A。等。2016年基因组生物学
5fC和5caC映射
5fC/5caC浸渍
使用5fC和5caC特异性抗体来富集这些标记。
沈,L。等人Cell 2013
MAB-序列
M.SssI处理DNA将所有C转化为5mC。亚硫酸氢盐转化将使所有C、5mC和5hmC读数为C。所有5fC和5caC读数为T。
Wu,H.,自然生物技术2014
fCAB-seq公司
伊顿酒店2保护基因组中的所有5fC在亚硫酸氢盐处理后不被氧化。
宋,X。等细胞2013
caCAB-seq公司
EDC用于催化形成酰胺键到5caC,防止5caC在亚硫酸氢转化过程中脱氨基。
卢,X。等2013年JACS
CLEVER系列
马来腈选择性标记5fC,生成5fC-M加合物,在测序中读作T。
朱,C。等细胞干细胞2017
表1:DNA修饰测序方法
如果你可以使用LC-MS/MS,那么这是量化总基因组DNA(Le等2011年和费尔南德斯等., 2018). 使用绝对定量方法,LC-MS/MS可以对任何生物体和细胞类型的总DNA中发现的所有DNA修饰进行平行定量(张等2012). 对于绝对定量,您只能限制使用哪些同位素标准作为测量样品的标准。
使用此技术结合DIP(DIP-MS)可以确定DNA修饰抗体是否与您感兴趣的修饰结合,还可以查看它是否与任何其他非特异性修饰结合。如果您生成DIP输入和下拉样本的LC-MS/MS数据,您应该会看到与输入相比,下拉样本中您感兴趣的修改有所增加。然后,你也可以用这些相同的数据检查其他修饰,看看是否有其他东西在你的样本中富集,以测试非特异性抗体结合。现在正在开发的软件甚至可以帮助您进行这种类型的分析。
LC/MS/MS:技术考虑技术上具有挑战性。MS设备昂贵且非常专业。机器本身需要大量的维护,通常需要自己的技术人员来控制。操作机器很复杂,需要专门培训,因此可能很难独自获得此类MS数据。如果您不可能购买自己的LC/MS/MS设备,请考虑通过合作或付费服务获取此数据。
也可以对DNA进行IHC/ICC修改。这可以通过对标准IHC/ICC协议进行一些简单的添加来实现。你需要考虑的最重要的区别是,抗DNA修饰的抗体如果位于双链DNA中,就不能与修饰结合。这意味着你需要使DNA变性,使其单链并被抗体所接触。最常见的DNA变性是用酸处理样品。通常是直接将4N盐酸(HCL)涂在IHC/ICC载玻片上(山口等2013年和Kaefer等., 2016). 将此步骤添加到您的方案中的最佳时间是在添加初级抗体之前。一旦你用洗涤剂(如PBS 0.1%Triton)使细胞或组织渗透,你可以清洗并添加4N HCl使DNA链变性。步骤完成后,必须彻底清洗酸,并用碱中和酸(例如PBS中的100µM NaOH)。酸洗和中和后,您可以继续进行常规的IHC/ICC步骤并添加一级抗体。当对DNA修饰进行IHC/ICC时,你也应该警惕你的抗体可能识别出RNA上非常相似的修饰(例如DNA上的5mC和RNA上的m5C)。为了避免这个问题,你可以用RNase步骤处理你的样本,去除所有存在的RNA。同样,这一步应该进行优化,因为将样本留在RNase中太长时间也会导致DNA受损。
DNA修饰IHC/ICC:技术考虑
计时你的酸步。
双重IHC/ICC。
选择正确的DNA染色剂。
5mC及其氧化衍生物在DNA去甲基化后的基因沉默和促进基因表达中起着重要作用。目前已知,其中一些DNA修饰可以作为标记物,将蛋白质招募到特定的DNA位点,改变基因表达并充当表观遗传标记。MBD3和甲基CpG结合蛋白2(MECP2)除5mC外,还可结合5hmC。一旦与5hmC结合,它们在DNA可及性和转录激活(Yildirim等2011年和梅隆等., 2012).
筛选DNA修饰的结合物的常用方法是使用下拉技术,然后使用MS筛选任何被下拉的蛋白质。该方法已成功用于寻找5mC、5hmC和5fC(Iurlaro等.、2013和Sprujit等., 2013). 对于这个实验,您需要创建一个合成DNA诱饵,其中包含您感兴趣的修饰,以及包含其他修饰和未修饰胞嘧啶的诱饵,以作为对照。这种DNA诱饵的一端应该与生物素分子相连,可以用来将诱饵拴在链霉亲和素连接的磁珠上。然后可以将感兴趣样品中的蛋白质提取物添加到系留诱饵中,并通过各种清洗步骤冲洗,以去除任何非特定结合蛋白质。在此之后,您可以洗脱剩余的蛋白质并进行MS分析,以找出您的特定粘合剂是什么。
MBD:技术考虑DNA序列。
修改次数。
清洗。
新的DNA修饰可能仍然存在,只是还没有被发现。已经证明,一些传统上被认为是RNA修饰的修饰也可能存在于DNA中。其中一个很好的例子是N6-腺嘌呤甲基化,即RNA中的m6A和DNA中的6mA。这种修饰是最著名和最丰富的RNA修饰之一,但现在已知它也存在于DNA中。2016年,John Gurdon的实验室(Koziol)首次进行了这项研究等., 2016). 他们显示6mA在非洲爪蟾小鼠和人类基因组使用6mA抗体进行DIP-seq。
自这项研究以来,又有几项声称斑马鱼和猪基因组中的DNA中存在6mA(刘等。,2016年),环境应激后的小鼠大脑(姚等。,2017年),并在拟南芥基因组(Liang等., 2018). 2018年的一项研究进一步揭示了分别负责6mA甲基化和去甲基化N6AMT1和ALKBH1的酶(肖等., 2018). 酶的存在积极地添加和删除DNA修饰,这表明它存在的真正目的以及潜在的表观遗传功能。
新型DNA修饰:技术考虑抗体可用性。
工具书类
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