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2022年11月10日更新
使用ChIC/CUT&RUN指南下载染色质分析
介绍
Henikoff实验室最近开发了一种新的染色质分析方法:靶下切割和使用核酸酶释放(CUT&RUN)(Skene等人,2018年;Skene和Henikoft,2017年)。这项技术提供了一个令人兴奋的进展,因为它克服了传统和广泛使用的染色质免疫沉淀(ChIP)方法的许多缺点。
CUT&RUN是染色质免疫切割(ChIC)的全基因组延伸,该方法由Laemmli实验室开发(Schmid等人,2004)。ChIC使用蛋白a-MNase融合蛋白来切割与目标蛋白和被特异性抗体识别。然而,ChIC仅限于使用Southern印迹进行局部特异性分析。
一种相关的方法,染色质内源性切割(ChEC),使用感兴趣的蛋白质和MNase之间的融合,以分析全基因组范围内蛋白质的结合位点(Schmid等人,2004;Zentner等人,2015)。这种方法的一个明显缺点是需要为每个感兴趣的蛋白质生成特定的融合蛋白。
与这两种方法相比,ChIC/CUT&RUN是一个重大进步,因为它使用通过抗体连接到感兴趣蛋白质位置的重组蛋白a/G-MNase(Meers等人,2019年;Skene和Henikoff,2017年)。 重要的是,此方法可以恢复MNase消化片段,因此与基于序列分析的全基因组蛋白质占有率和组蛋白修饰定位相兼容。
与基于ChIP的方法相比,其优点包括通过使用磁珠固定细胞核来提高方法的简单性,与新鲜和冷冻组织样品的兼容性,以及生成适合制备DNA测序库的材料的缩短方案(1-2天)。此外,由于就地靶向切割感兴趣蛋白质两侧的DNA,只有靶向DNA片段从细胞核中释放并收集,留下非靶向序列。因此,与ChIP相比,ChIC/CUT&RUN产生的背景信号非常少。
自开发以来,ChIC/CUT&RUN已被用于各种实验装置,包括高通量表观遗传分析自动化(AutoCUT&RUN)(Janssens等人,2018),不溶性染色质的分析,如着丝粒区中国国际商会/切割并运行。Salt(Thakur和Henikoff,2018)和中国国际商会/切割并运行。ChIP用于检测通过CUT&RUN消化释放的复合物中的特定蛋白质成分(Brahma和Henikoff,2019)。最引人注目的是,低输入要求和高信噪比意味着ChIC/CUT&RUN与单细胞分析兼容,例如用于研究单个小鼠胚胎细胞中转录因子的占有率(Hainer和Fazzio,2019)。
ChIC/CUT&RUN是一种简单、通用且功能强大的分析DNA-蛋白质相互作用的方法,应该包含在每个分子生物学家的工具包中。两者都有方法可以帮助全基因组鉴定以组蛋白修饰或与感兴趣的蛋白质结合为标志的特定基因和顺调控元件,从而提供对基于染色质的基因控制机制的见解。由于所需的起始材料非常少,中国国际商会/CUT&RUN是研究罕见细胞类型的唯一工具。除此之外,简单易用且节省时间的协议允许快速转换,使研究人员能够进行多个并行分析,因此,可以更全面地了解基因组调控的复杂性。
ChIC/CUT&RUN已被用于分析各种细胞系和组织样品以及多种模型生物(包括酵母、植物和动物细胞)中的DNA-蛋白质相互作用。到目前为止,所有这些研究都集中在组蛋白修饰和转录因子结合位点的定位上。
CUT&RUN的第一份报告描述了人类细胞系中的组蛋白修饰H3K27me3和酵母细胞中的H2A(Skene和Henikoff,2017)。ChIP Seq和ChIC/CUT&RUN生成的等效数据集的比较显示出密切的相似性在三种不同的染色质剖面技术之间发现“峰值”区域。
在过去的十年里,ChIP-seq一直是鉴定转录因子结合位点全基因组定位的主要方法。与ChIP相比,新的ChIC/CUT&RUN方法更具成本效益,使用速度更快,只需要一小部分起始材料,包括单个电池,具有更有利的信噪比,检测更明确的“峰值”,并且与自动化兼容。
这种方法与未固定的天然染色质兼容,甚至用于转录因子谱分析,因此克服了与交联ChIP协议相关的一些困难。 中国国际商会/CUT&RUN已被用于分析多种转录因子,如CTCF和多潜能因子,以及大型染色质相关复合物,如多梳抑制复合物和染色质重塑器。
不超过500000个细胞,标准为50000个细胞。低投入可用性和单单元协议,与自动化兼容。
标准甲醛交联方案,有时用DSG和甲醛双重固定
在大多数情况下使用用于分离和溶解染色质的交联协议
在传统的交联方案中没有酶裂解,只有在免疫沉淀前使用MNase片段DNA的原生方案
末端修复和接合器结扎方案需要低输入DNA样本
在ChIC/CUT&RUN过程中,使用针对感兴趣蛋白质的抗体(例如具有特定修饰或转录因子的组蛋白)来引导蛋白a/G标记MNase到蛋白质所在的基因组区域。激活MNase后,只会删除那些与感兴趣的蛋白质接近的DNA序列,然后从细胞核中释放出小片段。收集这些DNA片段并使用低输入DNA文库准备试剂盒生成NGS文库。
图1。ChIC/CUT&RUN协议示意图。细胞核附着在磁性伴刀豆球蛋白A珠上,便于在每次清洗后处理和安全地清除液体。细胞核被渗透,同时与针对感兴趣蛋白质的抗体孵育。蛋白A/G-MNase融合蛋白与针对感兴趣蛋白的抗体结合。当Ca2+添加MNase后,MNase裂解形成复合物两侧的DNA,并释放出扩散出细胞核的DNA片段。DNA可被提取并用于基于末端修复和适配器连接的DNA文库制备。NGS通过特定区域中序列的频率通知感兴趣蛋白质的结合谱。
中国国际商会/CUT&RUN通常使用新鲜、未固定的样品作为起始材料,但方案调整可以允许使用在10%二甲基亚砜中冷冻保存的样品(Janssens等人,2018;Skene等人,2018)。
执行该方案所需的材料很少,一般建议从少于500000个细胞(哺乳动物)开始。
用Henikoff推荐的核提取缓冲液释放的细胞或细胞核与伴刀豆球蛋白A磁珠结合,该磁珠具有独特的糖结合特性。可使用其他核提取协议,以提供其兼容性(见下文关于使用Triton X-100含缓冲液的建议)。使用磁性支架可以在协议的剩余时间内轻松清洗样品。
与伴刀豆球蛋白A结合的细胞核被渗透,并在含有洋地黄素和EDTA的缓冲液中与针对感兴趣蛋白(一级抗体)的抗体同时孵育。EDTA可快速停止细胞代谢从而抑制内源性DNA酶活性,保留染色质并降低整体背景信号。用户可以调整此步骤的持续时间;一般为2h至隔夜。建议以1:100或0.51.0µg的抗体稀释度作为起点,但应优化抗体用量。建议始终包括阳性(α-H3K27me3)和阴性对照(同型对照IgG)样品。
值得注意的是,蛋白A和蛋白G对不同抗体种类具有不同的结合效率(参见此处)。即使通过使用蛋白A/G而不是单独使用蛋白A来提高抗体相容性,在某些情况下可能需要使用第二抗体。二级抗体通过增加蛋白A/G结合区的数量引导MNAse到达靶区,从而帮助恢复低丰度的靶序列。
为了使蛋白A/G-MNase能够被导向抗体结合的基因组靶区,将融合蛋白在含有洋地黄素的洗涤缓冲液中稀释,并与细胞核一起孵育。然后冲洗掉未结合的酶融合,并通过添加Ca在0°C下激活MNase活性2+。尽管切割本身对温度并不特别敏感,但切割的DNA片段随后的扩散是敏感的,温度升高会导致更高的背景。消化如果最终材料中含有不成比例的高分子量碎片,则可以调整时间。
MNase活动通过添加包含EGTA的STOP缓冲区来停止。该缓冲区可以选择性地包含异源尖峰DNA,以帮助在数据处理期间校准CUT&RUN配置文件。MNase生成的片段从通过提高孵育温度和使用苯酚/氯仿/异戊醇萃取净化细胞核,然后进行乙醇沉淀。
方案的改变可以进一步限制MNase融合蛋白从其结合位点的过早释放、扩散和非特异性切割的可能性。
此版本的协议使用低盐缓冲液和高Ca的组合2+激活MNase活性的浓度,是主要在活性开放染色质中发现的理想靶点,但也可以在抗体显示高水平背景信号时使用。
根据制造商的指南,在清理切割的DNA片段后,使用标准末端修复和适配器连接方法生成低输入DNA库。Henikoff实验室最初建议使用TRUseq库准备方法,此外,现在已有多份报告使用NEBNext®Ultra™II DNA库试剂盒。或者,类似于自动CUT&RUN协议(Jenssens等人,2018),苯酚/氯仿/异戊醇提取步骤可以省略,释放的DNA片段可以直接用于末端修复和基于适配器连接的协议。
文库的大小分布和浓度可以通过毛细管电泳(例如生物分析仪或TapeStation)来确定。多个库可以合并在一起,以获得每个库大约800万个配对测序读取。由于ChIC/CUT&RUN库的背景较低,800万对基因读取足以分析组蛋白修饰甚至转录因子。
大多数传统的ChIP-seq数据分析工具可以分析ChIC/CUT&RUN数据。有一些分析工具,例如SEACR峰值调用者(Meers等人,2019b),它们是由Henikoff实验室专门为中国国际商会/切割和运行数据。用于校准中国国际商会/CUT&RUN,添加STOP缓冲液的异源尖峰DNA可用于使样本间的信号正常化。或者,大肠杆菌从重组产生的蛋白A/G-MNase携带的DNA可以用作插入物。
样品制备
通常,样品制备对于ChIC/CUT&RUN来说很简单,因为它可以使用新鲜的、未固定的样品。需要实现单细胞悬浮以适合所用电池类型的方式。这可以包括使用Accutase™等解离试剂、从细胞培养皿上刮下细胞或机械解离组织。
为了便于收集,样品可以在10%二甲基亚砜中低温保存并冷冻在Frosty先生的异丙醇室里。两种方法都不需要固定样品,但是,如果水珠在洗涤过程中结块,则在抗体孵育前,在室温下使用0.1%甲醛将样品轻固定2分钟是有益的。
至于ChIP,并不是所有的抗体都能对ChIC/CUT和RUN起作用。大多数抗体尚未测试与这些新方法的兼容性,因此最终用户需要进行测试和优化。ChIP颗粒抗体似乎在很大程度上对ChIC/CUT&RUN有效,特别是当显示对天然ChIP有效时。
当试验未标记为ChIP级的抗体时,假设特异性得到充分表征,那么最好从选择识别感兴趣蛋白质的天然形式的抗体开始;例如,已经证明在免疫沉淀或免疫细胞化学中起作用的抗体。同样,当考虑在ChIC/CUT&RUN实验中使用的抗体浓度时基于免疫荧光的方法推荐的浓度似乎是一个很好的起点。需要检查与蛋白A和蛋白G的相容性,必要时需要使用适当的二级抗体。
与任何其他实验类型一样,包括正确的控制对于确保实验按预期工作以及在实验失败时轻松确定要排除故障的区域至关重要。
与ChIP不同,协议中不需要包含输入样本,因为非抗体引导的MNase治疗或标记只会导致识别可访问的染色质。应包括一个IgG对照物,以从样本中获取背景并设置实验的基线。在抗体控制方面,Henikoff实验室建议使用H3K27me3作为阳性对照中国国际商会/切割和运行实验。使用总的未修饰组蛋白对照物,如总H3,可以考虑允许组蛋白修饰的比例表示。
使用此技术时,需要在几个阶段对ChIC/CUT&RUN协议进行优化。
在最初版本的方案中,需要测试洗涤缓冲液中使用的洋地黄素浓度,以确保细胞核的有效渗透。如果您对协议进行了改进,特别是通过向清洗缓冲区中添加NP40,则可能没有必要进行此测试。然而,在新材料上使用这两种技术时,应牢记原子核渗透的效率。
从ChIP或免疫荧光分析的推荐稀释液开始,滴定每次反应使用的抗体量非常重要。
一级抗体在室温下孵育1小时就足够了,但在冷藏室中可以延长至1至5天。这一步骤可以针对每个实验中使用的抗体进行优化,要记住,长时间培养可能会导致背景信号增加,因此总体上信噪比不太理想。
如果仅使用一级抗体恢复率低,则可以考虑使用二级抗体进行ChIC/CUT&RUN。包含二级抗体的另一个原因是为了避免蛋白质a/G与一级抗体的不良配对,这可以通过使用更有利的二级抗体类别来实现。
MNase消化和Tn5标记时间可以根据感兴趣的蛋白质进行调整。不太丰富的蛋白质可能需要更多时间才能完全恢复所有位点。重要的是要记住,长时间的消化或标记可能会导致非靶向卵裂,因此,背景信号更高。
-Henikoff实验室提供的标准CUT&RUN协议(版本3)
-专门的ChIC/CUT&RUN协议用于果蝇组织
-使用NEBNext®Ultra™II DNA的ChIC/CUT&RUN兼容库准备协议 图书馆准备工具包
常见问题解答
我的模型生物的基因组比人类/小鼠小,我应该先增加细胞数量吗?不建议每个样本超过500000个细胞。一般来说,一个好的起点是50000个细胞。与ChIP不同,ChIC/CUT&RUN非常敏感,不需要数百万个细胞作为起始材料。使用太多的单元格将降低产量,更重要的是,会降低库的复杂性。
每次实验使用的细胞数量不应超过500000个。由于方案中的珠子数量针对50000到500000个细胞的使用进行了优化,因此无需增加方案中建议的珠子数。
建议在适当的缓冲液或介质中使用10%二甲基亚砜,并使用Mr.Frosty异丙醇室缓慢冷冻。不建议快速冷冻。
根据ChIP样品的固定和冷冻保存条件,这可能是可行的。然而,这不太可能与标准方案一起使用,因为ChIP样本的细胞数可能会超过ChIC/CUT&RUN样本的推荐值,并且所使用的强固定条件(如双重固定和淬火)会损害MNase或Tn5活性。
ChIP样本中的细胞数超过ChIC/CUT&RUN的推荐细胞起始材料的问题可以通过将样本拆分为多个细胞轻松解决。然而,样品的固定和冷冻的其他问题仍然存在。ChIP协议中使用的固定可能过于苛刻,无法与任何一种协议兼容中国国际商会/CUT&RUN,因为它很可能会削弱MNase或Tn5对目标序列进行片段化/分段的能力,而且多份报告暗示了这种不兼容性。此外,由于固定,有可能出现表位掩蔽。因此,不建议固定样品。当冷冻保存细胞用于中国国际商会/CUT&RUN,使用10%DMSO和Mr。需要使用霜状异丙醇室轻轻冷冻样品。不建议在大多数ChIP协议中包含闪存冻结。
结块问题可能是由于使用了过高的细胞与珠的比率或含有洋地黄素的缓冲液中细胞核/细胞的溶解,这会释放DNA并导致结块。首先要检查推荐的不超过单元格数。此外,建议在与抗体孵育之前用甲醛进行轻度固定(室温下用0.1%甲醛固定2分钟),以减少含有洋地黄素的洗涤缓冲液中珠的结块。然而,请记住,固定可能会影响表位的可用性,因此需要对每种抗体进行测试。
建议在渗透和抗体培养缓冲液中添加EDTA,因为EDTA螯合镁2+从而停止任何ATP依赖性细胞过程,包括复制和染色质重塑,它还将停止内源性DNA酶。
这两种融合蛋白最初都由Henikoff实验室提供。有关于如何制造自己的融合蛋白的协议(Kaya-Okur等人,2019年;Meers等人,2019a),而质粒、蛋白A-MNase、蛋白A/G-MNase和蛋白A-Tn5都可以从试剂供应商处购得.
携带量取决于起始细胞的数量以及抗体表位的丰度,起始细胞的数目与对应的测序读数的数目成反比大肠杆菌DNA。携带量还取决于使用的伴刀豆球蛋白A珠子的数量,因此使用的珠子越多大肠杆菌读取。总的来说,校准使用大肠杆菌携带的DNA只能用于在使用的细胞和珠子数量上具有可比性的实验。
作为指导,Henikoff实验室报告了一系列大肠杆菌读取百分比从总读取的0.01%到11.5%,IgG样本通常具有较高数量的大肠杆菌读数(2%至11.5%)。他们还报告说,在实验中仅使用几百或几千个细胞时大肠杆菌阅读量可以达到30%到70%。此外,当测试一种商用融合蛋白时,他们只得到了总读数的0.01%大肠杆菌读取,可能太少,无法用于数据规范化。
与ChIP类似,qPCR可用于检测精心设计的感兴趣区域。请记住,反应需要在扩增的文库中进行,而不是在生成的DNA片段库中进行。在ChIC/CUT&RUN的情况下,释放的片段通常包含未被抗体定向MNase直接靶向的大基因组区域。这些片段不会对从这些样品中制备的文库产生影响,但会通过qPCR进行扩增。为避免假阳性,qPCR的模板应为扩增文库,并应进行适当的控制。
好消息,很可能你没有做错任何事!如果阳性对照样品(如H3K27me3)返回了良好的核糖体模式,那么了解转录因子样品是否有效的唯一方法就是对样品进行测序。
不幸的是,转录因子库看起来与IgG库非常相似是很常见的,但在测序后,它们仍然产生高质量的数据集。您可以选择qPCR方法来比较IgG和已知转录因子靶点的转录因子库中的信号。
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