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细胞代谢中这一关键调控位点的结构、调控和分析。
丙酮酸脱氢酶复合物(PDH)将柠檬酸循环和随后的氧化磷酸化连接到糖酵解、糖异生、脂质和氨基酸代谢途径。
PDH催化丙酮酸的氧化脱羧反应生成乙酰辅酶A(乙酰-CoA)、NADH和CO2PDH促进碳水化合物的使用,以满足能量需求:当哺乳动物的碳水化合物储存量耗尽时,PDH活性被下调,以通过氧化磷酸化限制葡萄糖的使用。脂肪酸或酮体随后被用作心脏和骨骼肌等组织的能源。
PDH是一种9.5 MDa复合物,由三种酶的多拷贝组成:丙酮酸脱氢酶(E1)、二氢硫酰胺转乙酰酶(E2)和二氢硫胺脱氢酶(E3)。另外一个结构亚单位E2/E3结合蛋白是支持E2和E3亚单位之间相互作用所必需的。
PDH活性被Ser232、Ser293和Ser300的E1α亚基的可逆磷酸化所抑制。这些位点的磷酸化是由PDH激酶的异构体(PDK1-4)催化的。PDH磷酸酶(PDP1和PDP2)催化去磷酸化以恢复PDH活性。激酶和磷酸酶在组织中均有差异表达,它们的转录受多种细胞应激事件控制,如饥饿、低氧或高浓度NADH、乙酰辅酶a或钙。
在代谢综合征(如糖尿病和肥胖)中,经常观察到葡萄糖和脂肪酸作为能量来源的失调使用。此外,癌细胞通常从氧化磷酸化转变为糖酵解以产生ATP。PDH在这些活动中的中心作用使人们重新对PDH的活性和调控作为一种潜在的治疗工具产生了兴趣。
你选择的研究PDH活性的方法取决于实验条件和你试图回答的实验问题。
细胞和组织提取物中内源性和磷酸化PDH活性的量化。
测量内源性PDH活性的关键是保持体内磷酸化状态。我们的提取和免疫捕获缓冲液被配制成抑制特异性和非特异性激酶和磷酸酶,以防止在样品制备过程中出现不必要的PDH修饰。
样品制备好后,活性酶可以在固体表面进行免疫捕获和分析,使用96-well微孔板格式或油尺分析格式此方法比经典的使用方法更简单、更快、更安全[14C] 丙酮酸及其酶促释放的测定[14C] CO公司2.
还可以分析PDH活性体外以下内容PDH免疫捕获去除内源性激酶和磷酸酶。然后用磷酸化样品重组PDK或用脱磷重组PDP测定(a)完全磷酸化PDH的残余活性,(b)完全去磷酸化酶的最大活性和(c)内源性未修饰PDH的活性。
活细胞或细胞和组织提取物中总PDH和磷酸化PDH的定量
PDH的关键调节亚单位是E1-α亚单位(PDH1),在三个丝氨酸磷酸化位点被激酶修饰以降低活性。
PDH E1-α和改性磷素(Ser232、Ser293和Ser300)总量的量化可以使用夹心ELISA分析这种方法测量蛋白质和磷酸化水平,无论是内源性的还是药物治疗的结果。
细胞内ELISA(ICE)检测可用于测量培养活细胞中翻译后修饰的蛋白质水平。ICE方法的优点是可以在96或384孔板中快速固定细胞就地稳定酶磷酸化并消除样品制备过程中可能发生的任何变化。
用western blot、流式细胞术或免疫细胞化学分析活细胞或细胞和组织提取物中的PDH亚基
PDH复合体的缺陷是导致乳酸酸中毒的重要原因,也是导致儿童Leigh病的原因。PDH缺乏症的大多数病例是由于X连接的E1α亚基的突变引起的,尽管其他亚基也有突变的报道。
我们的抗体已经通过免疫沉淀、蛋白质印迹、免疫细胞化学(ICC)和ELISA检测相结合的方法进行了靶向特异性测试。