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ab 102784数据表规定洗脱程序为洗脱缓冲液的x4清洗步骤加上中和剂的中和步骤。需要使用中和剂以避免抗体变性。四个试管中的每一个都必须进行蛋白质测试(通常在试管1和试管2中进行抗体洗脱)。如果不建议使用Bradford分析,因为中和剂含有干扰分析的成分,那么如果错误地将中和剂添加到试管中,我们可以使用哪种蛋白质测试方法?
Abcam社区
已验证客户
2013年3月28日被问及
蛋白质值应使用280nm的吸光度测定。我已经与我们的科学家进行了核实,他们告诉我,280nm处的吸光度(或OD)为1对应于0.1714mg/ml的抗体浓度。请注意,只有在1cm试管中测量的IgG才有这个值。通过查阅参考文献和其他来源,您应该能够找到您试图纯化的抗体的适当吸光度-浓度系数,这些信息可以在网上找到。根据http://www.mainebiotechnology.com/documents/3528_C007.pdf可以使用以下协议:280海里吸收率的抗体浓度测定纯化抗体浓度的最快方法之一是在280 nm处吸收(A280)。为此,需要一个紫外可见分光光度计来检测在紫外范围内透射的光。含有芳香氨基酸残基色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的蛋白质吸收波长约为280nm的光能。根据这三种氨基酸的已知数量,每个蛋白质都有自己的消光系数。在这里,在免疫球蛋白的情况下,成分差异在很大程度上可以忽略。吸光度越大,蛋白质的浓度越高。为了获得满意的结果,制剂的纯度必须大于95%。程序1.打开分光光度计并将设置调整为280 nm。2.稀释样品,使蛋白质浓度估计为0.5–1.5 mg/ml。如果样品高度浓缩,则制备两种不同的稀释液(例如1:5和1:10)以确认结果。3.用稀释剂填充试管。当分光光度计有足够的时间预热时,插入带有稀释剂的比色杯,并将读数调整为“0”4.清空试管并夯实干燥。将足够多的稀释样品转移到比色皿中,短暂混合并丢弃该样品。将另一体积的相同样本转移到试管中。插入分光光度计并记录数值。5.丢弃样品。如果有第二个浓度更高的样品,将其转移到试管中。再次,简单混合并丢弃。转移相同体积的样品并插入分光光度计。记录数值。6.测定稀释样品的浓度。样品的吸光度读数除以表7.2中显示的适当值。图表显示了如果抗体浓度为1.0mg/ml,吸光度读数应该是多少(消光系数)。7.因此,如果IgG样品吸光度为0.75,则浓度为0.75÷1.36=0.55 mg/ml。如果这恰好是原始样品的1:5稀释,则原始样品的浓度为0.55×5=2.75 mg/ml。各种免疫球蛋白的消光系数1.0 mg/ml时的蛋白质组分吸光度IgG 1.36免疫球蛋白1.18IgA 1.32IgE 1.53IgG F(ab)1.50IgG F(ab)′2 1.48
2013年3月28日答复